의 유사 분열 유학을위한 Microinjection 기법 Drosophila melanogaster Syncytial 엠브료
Summary
이 프로토콜은에 microinjection과 고해상도 이미지의 사용에 대해 설명합니다<em> Drosophila melanogaster</em유사 분열을 공부> syncytial 배아.
Abstract
이 프로토콜은 유사 분열 1 공부에 대한 Drosophila melanogaster syncytial 배아의 사용을 설명합니다. Drosophila는 합성의 게놈과 유용한 유전자를 가지고 있으며, 쉽게 유지하고 조작하실 수 있습니다. 많은 mitotic의 돌연변이가 존재하고, (예 : GFP) 찬란 기능적 표현 형질 파리 – 태그 mitotic 단백질이되었으며 생성되고 있습니다. 타겟 유전자 발현은 GAL4/UAS 시스템 2를 사용 가능합니다.
Drosophila 초기 배아는 (세포주기 기간, ≈ 10 분) 매우 빠르게 여러 mitoses를 수행합니다. 사이클 10-13 동안 핵 막 피질 아래 단일 monolayer의 배 (胚)의 표면에 cytokinesis을 개입하지 않고 빠르게 분열과 동기 때문에 잘, 영상 유사 분열에 적합합니다. 이러한 급속하게 나누어 핵은 아마도 다른 세포와 같은 mitotic 기계를 사용하지만, 그들은 속도에 최적화된되며 검사점 일반적으로 그의 부재 강한 검문소와 세포 세포주기 체포를 일으킬 것입니다 mitotic 단백질의 연구를 수 있도록 엄격한되지하는 생각입니다 . 또는 GFP 표시된 단백질을 표현 배아는 찬란 표시된 단백질과 microinjected 쉽게 라이브 역학 (그림 1)에 따라 몇 군데 있습니다. 또한, 배아들은 기능 3의 손실 또는 섭동의 효과를 연구하기 위해 특정 단백질의 기능을 차단 항체 또는 억제제와 microinjected 수 있습니다. 이 시약은 억제제의 농도의 그라데이션, 돌연변이의 allelic 시리즈에 비해 결함의 기울기에 차례 결과 인치를 생산하기 위해 많은 스핀들에 도달, 배 (胚)에 걸쳐 확산 수 있습니다 이상적으로, 대상 단백질이 찬란 표시된 경우 억제의 기울기는 4 직접 시각하실 수 있습니다. 그것이 공식적으로 항체가 적용되어야합니다 드물 때문에 엄격한 컨트롤 및주의 해석에 지배적인 영향을 수있는 가능성을 제외하기 힘들지만 그것은 가장 강한 표현형가 NULL 표현형 비교는 것을 가정합니다. 멀리 사출 사이트에서, 단백질의 기능은 부분적으로 타겟 단백질의 다른 기능은 분명이 될 수 있도록 손실됩니다.
Protocol
Discussion
이 프로토콜은 그러나 각 단계는 배아가 손상되지 않도록 연습을 필요로 상대적으로 간단합니다. 주의 제어 실험은 항상 신뢰할 수있는 결과가 취득되는 것을 보장하기 위해 수행해야합니다. 이것을 시작하는 한 가지 좋은 방법은 유사 분열은 배아 표면 (사이클 13를 통해 10)의 모든 사이클을 통해 정상적으로 진행되었는지 확인하기 위해 GFP – tubulin을 표현하는 제어 배아에 버퍼 또는 rhodamine tubul…
Acknowledgements
이 프로토콜은 현재 저희 실험실에서 사용되고 DRS 데이비드 샤프, Mijung 권, Patrizia Sommi, Dhanya Cheerambathur를 포함한 많은 사람들이 지난 몇 년 동안 정제되었습니다. 우리는이 시스템에서 우리의 작업이 시작 받고 초기 Drosophila의 배아의 조작과 microinjection (ref. 13)에 대한 훌륭한 조언으로 우리를 제공 박사 빌 설리반 (UCSC)를 주셔서 감사합니다. 우리는 스칼리 연구소의 모든 구성원 감사합니다. Drosophila에서 유사 분열에 우리의 작품은 NIH 부여 GM55507에 의해 지원됩니다.
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