Uma célula de ensaio de morte com base em plantas para PTI Nicotiana benthamiana é descrito.
Para perceber patógenos potenciais em seu ambiente, as plantas usam receptores de reconhecimento de padrões (PRRs) presentes nas membranas seu plasma. PRRs reconhecer recursos microbianos conservada chamado patógeno-padrões moleculares associados (PAMPs) e isso leva à detecção de PAMP disparado imunidade (PTI), o que efetivamente previne a colonização de tecidos vegetais por patógenos não 1,2. O sistema mais bem estudado no PTI é a via de três FLS2-dependente. FLS2 reconhece a flg22 PAMP que é um componente dos flagelos bacterianos.
Patógenos de sucesso possuem fatores de virulência ou efetores que pode suprimir PTI e permitir que o patógeno para causar a doença 1. Algumas plantas, por sua vez possuem genes de resistência que detectam efetores ou sua atividade, o que leva a efetoras disparado imunidade (ETI) 2.
Descrevemos uma célula de ensaio da morte-based para PTI modificado a partir Ah, e Collmer 4. O ensaio foi padronizado em N. benthamiana, que está sendo usado cada vez mais como um sistema modelo para o estudo da planta-patógeno interações 5. PTI é induzida pela infiltração de uma cepa não-patogênica bacteriana em folhas. Sete horas depois, uma cepa bacteriana que causa a doença tanto ou que ativa ETI é infiltrado em uma área de sobreposição da zona de infiltração original. PTI induzida pela infiltração primeiro é capaz de retardar ou prevenir o aparecimento de morte celular, devido à infiltração segundo desafio. Por outro lado, a aparência de morte celular na área de sobreposição de inoculação indica uma repartição dos PTI.
Quatro combinações diferentes de indutores do PTI e inoculações desafio foram padronizados (Tabela 1). O ensaio foi testado em não-silenciadas N. benthamiana plantas que serviram como controle e plantas silenciadas para FLS2 que estava previsto para ser comprometida em sua capacidade de desenvolver PTI.
A célula de ensaio de morte podem ser usadas para determinar o envolvimento de um gene no PTI. Por exemplo, perda de função mutantes para um gene de interesse pode ser testado com este ensaio. Das 4 combinações de indutor e inoculações desafio dada na Tabela 1, é possível que apenas uma combinação pode resultar em um fenótipo em seu fundo de plantas. Temos observado que as plantas silenciadas para FLS2 mostrar uma avaria do PTI na Pf / DC e Pf/Q1-1 combinações de indutor e inoculações desafio (Tabela 1).
É essencial que as condições ambientais para o ensaio são o mais próximo possível às descritas na parte 3.1. A baixa umidade provoca a morte celular para continuar rápido demais, tornando o ensaio difícil de marcar. Se as condições descritas no nosso protocolo não funcionam em seu laboratório, em seguida, tentar alterar o nível de indutor ou inoculação desafio. Outro parâmetro que pode ser modificado é o intervalo de tempo entre indução e desafio, embora tenhamos encontrado que as lacunas de tempo mais curto fez com que o ensaio de quebrar muito rapidamente em plantas controle.
Recomendamos que, pelo menos, 4-5 plantas ser testado em um experimento e um fenótipo positivo deve ser repetido em pelo menos 3-4 experimentos independentes.
Agradecemos a Hye Sook-Oh, Joanne Morello e Alan Collmer, Departamento de Fitopatologia e Biologia Vegetal-Microbe, Cornell University, pelas valiosas discussões. Agradecemos a Jesse Munkvold para comentários sobre o artigo. O financiamento foi fornecido pelo National Science Foundation Programa Genoma Plant, número prêmio DBI-0605059 (GBM).
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
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MES | Fisher Scientific | BP300-100 | Prepare as a1M stock, adjust pH and filter sterilize. Store at room temperature. | |
Life Science UV/Vis Spectrophotometer | Beckman Coulter | DU 730 |