抗体分析的荧光素酶免疫沉淀系统（LIPS）

Summary

唇（荧光素酶免疫沉淀系统）技术方面进行了阐述。总体方法涉及表达嵌合基因编码融合海肾荧光素酶（中国人民大学）在哺乳动物细胞中的抗原。原油中国人民大学抗原的提取，然后准备，没有净化，量化抗体免疫检测。

Abstract

为全面了解和量化抗体型材自身抗原和传染性的技术到疾病的机制，可能会产生新的见解，并阐明新的标志物substratify与不同的临床特点疾病，并更好地理解发病机制。我们已经开发出一种高度的定量方法叫荧光素酶免疫沉淀系统，用于分析病人血清抗体反应与感染有关的自身抗原和病原体的抗原（LIPS）。与酶联免疫吸附，高度敏感的嘴唇很容易实施调查体液的一个普遍的格式的不同抗原的血清学反应概况，并产生抗体滴度的动态范围可达6日志<sub> 10</sub对某些抗原。在这些研究中，嘴唇对抗原板，甚至一些病原体（即艾滋病毒）的整个蛋白质组病人的体液免疫应答的定量分析，通常多用ELISA测试的单一抗原信息。此外，嘴唇也消除了生产所需的高度纯化的抗原，以及劳动力密集型的标准的酶联免疫吸附测定优化所需的步骤的时间和努力。在这里，我们提供了一个详细的描述执行嘴唇容易分析单个或多个抗原抗体反应检测技术方面的协议。

Protocol

1。原理概述： 本视频演示了在执行嘴唇检测所涉及的步骤。 Cos1重组海肾荧光素酶（中国人民大学）抗原的融合，和原油中提取的细胞抗原的表达，得到了和没有净化使用。唇部检测发起的孵化与病人血清中微量井CRUD Ë中国人民大学抗原提取物。抗原抗体的混合物，然后转移到一个96孔过滤板，含蛋白质A / G的珠捕获IgG分子。洗涤后过滤板，含有蛋白质的抗体必然中国人民大学抗原是腔肠基板和光单位除了测量A / G的珠片，用光度计测量。 第1部分：生产海肾抗原的融合蛋白的质粒转染 设置：Cos1细胞在DMEM培养液，10％，使用标准的组织培养协议的FCS培养。 海肾荧光素酶融合质粒已被描述以前1。这些质粒DNA准备使用自Qiagen一个Midiprep套件。产量应约为1 -3毫克。测量DNA浓度为1000微克/毫升于-20 ° C原液和存储程序： 前一天的转染分割COS – 1细胞到新的100 × 20毫米菜约2 × 10％在37板孵育 6 ° C. 翌日，COS – 1细胞应该是80-95％汇合。标签1.5 mL聚丙烯离心管每个质粒DNA转染。允许FuGENE 6转染试剂，这是保存在4 ° C，预热到室温。 每个离心管加入94μLOPTI – MEM媒体。接下来添加6 FuGENE 6μLOPTI – MEM媒体而不触及池壁。 孵育的混合物在室温下5分钟。 添加1-2微克海肾荧光素酶的抗原融合质粒（1mg/ml的DNA的股票）构造。混合，然后在室温下15分钟的孵育混合物。 细胞的DNA，FuGENE 6 OPTI – MEM解决方案，它均匀地滴落到Cos1细胞媒体。 第2部分：收获海肾抗原的融合两天后转染COS – 1细胞的收获。这是消除媒体和6毫升的PBS漂洗细胞发起。调迁的PBS后，移液器远离组织培养皿中的任何残留的PBS。 加入1.4毫升冷裂解液组成，pH值7.5的50 mM的Tris，100 mM氯化钠， 氯化镁 2 5毫米，1％的Triton X – 100的，50％的甘油和蛋白酶抑制剂（2片，每50毫升的完整miniprotease抑制剂的鸡尾酒裂解缓冲液）。收获细胞与细胞刮板迅速转移裂解液的一半，每两个1.5 ml离心管放在冰上。 一个布兰森Sonifier 150是用来打破的细胞。放置的离心管中含有冰和脉冲的细胞裂解液为5秒，5秒和5秒，2，2和4的超声设置，分别。 两个4分钟的转速为4 ° C离心细胞裂解液在12500转后的第一个旋转，轻轻反转管，管的侧壁去除松散附着的杂物。第二自旋后，小心将上清转移，不中断的颗粒，从两管到一个新的离心管放在冰上。 计算每μL的细胞裂解光单位（LU）的。要衡量的LU，1μL裂解液稀释8的PBS液中的一个新的离心管。直接加入100μl1X腔肠基板的稀释后的混合物，并立即测量在使用一个5秒读管一管光度计（20/20 ñ特纳科学）的发光。 商店中国人民大学在-20 ° C -抗原裂解1-2天或不再分装的时间内存储在-80 ° C。 第3部分：准备一个色拉寺主板块首次加入450缓冲液（，pH值7.5的50 mM的Tris，100 mM氯化钠， 氯化镁 2 5毫米，1％TRITON X – 100）每一个深96井的聚丙烯微孔板以及一个血清主板。染料，酚红，在这一步，也可以包括在缓冲区中（终浓度为0.2微克/缓冲液的）作为示踪剂监测未来的血清样品除了和其他步骤的嘴唇检测。 从每个样品中添加50μL血清中含有450μL缓冲液A的不同井注意这是一个在缓冲液A血清1:10稀释血清通常是不会被添加到主盘的最后两井，因为这是预留的缓冲空白。 在使用主盘之前，它被广泛地动摇（1-2小时）一个旋转平台上。在主盘的血清是STABLE至少1个月在4 ° C，如果正确存放，以防止水分蒸发（或更长）。 正如下文所述，此主控板提供10μL稀释后的血清中被反复删除针对多种抗原的血清分析。较大和较小的主控板，也可聘用。它不被使用时，用封口膜板密封。 第4部分：二合一检测聚丙烯96浅孔板用于测试血清。在第一步中，添加40缓冲液A液，每孔96使用一个8通道的微管板。 下一步采取10μL稀释血清（1μL血清当量），从主盘，并直接将它添加到每一个工作板使用一个8通道的微管以及。 1 × 10 7光单位（LU）的是，每孔50缓冲液中添加了一个含中国人民大学抗原提取，是一个主混合未来制订。较低的输入（低至1 × 10 6），也可以使用，但在一个较低的动态范围的结果。使这个主混合物和中国人民大学的抗原混合物加入50μL，每孔。 孵育在室温下1小时旋转振动筛板。 在孵化期间，到每一个新的96孔过滤高温超导板（Millipore公司，贝德福德，马萨诸塞州）以及的底部添加5μLULTRALINK蛋白A / G的珠（皮尔斯生物技术，罗克福德，IL）在PBS的30％悬浮液。 1小时的潜伏期后，中国人民大学100μL抗原抗体反应混合物转移至96孔过滤高温超导板块包含A / G的珠使用一个8通道的微管蛋白。 孵育96孔过滤板在室温下的额外1小时旋转振动筛。 接下来，洗真空歧管上的过滤板。每孔100μL缓冲液A洗了8次，100μL的PBS的2倍。这可以执行手动或使用一个机器人移液工作站。 最后一次洗涤后，真空是关闭的。取出滤板和印迹干燥使用一摞纸毛巾或滤纸，一定要去掉水分的顶部和底部的钢板。 第5部分：测量发光与数据分析设置： 一个贝特霍尔德LB 960炫酷微孔板光度计是用于确定在每口井用一个单一的喷油器的发光。一旦机，H 2 O，用蒸馏水冲洗进样器使用注射器冲洗周期。腔肠基板准备使用Promega的海肾荧光底物试剂盒制造商。通常6毫升1X腔肠基板组合（即60μL腔肠股票1​​X缓冲液加6毫升）准备启动机器，并运行一个完整的96孔板。贝特霍尔德LB 960炫酷微孔板发光分析板之前，催芽1X腔肠基板。打开一个程序文件，其中包含注入基板和阅读板的设置。对于这些测试，注入50μL腔肠基板，板发光读5秒，2秒动摇。 虽然板光度计有能力阅读整个板块，也可以被选中的板块的部分读（读菜单下）。启动程序，启动的板块中读取。 运行后，酶标滤板及时删除，以防止溢出在光度计。导出成Excel格式进行分析MikroWin程序产生的数据。 我们建议从两个独立运行的血清评估。然后，数据平均每个样品产生的LU滴度值。这些值可以进一步调整，减去缓冲区的空白。 额外的数据分析，如确定可以取均值加3或5的控制值的标准偏差计算截止。

Discussion

LIPS需要最小检测优化，由于其简单，通常可以用在两个星期的嘴唇在任何特定的抗原产生高质量的数据。最耗时的步骤是克隆，并产生相应的质粒表达载体，含中国人民大学抗原融合。一旦产生这些质粒，可单个或多个抗原快速测试用嘴唇上面所述。应该指出，嘴唇是相当通用的，也可以在管格式或者一个与援助的一个BIOMEK机器人^工作站2或洗板机，真空过滤的过滤板酶标检测血清。这种高度可扩展的系统可为人类自身抗原或^病毒 4的全蛋白质组的小组分析并行的嘴唇。这可能是许多不同的抗体生成的配置文件由LIPS将用于^3-9诊断，发现⁹抗原^，10治疗，疫苗监测过程中，并为特定的疾病状态，和广大市民的健康广泛的影响。

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
HiSpeed Plasmid Midi KIt		Qiagen	12643
100 x 20 mm tissue culture dishes		Fischer	353003
Opti-MEM		Invitrogen	31985
FuGENE 6		Roche	1814443
Complete, Mini protease inhibitor cocktail		Roche	11836153001
Polypropylene 96 DeepWell 1 ml plate		Fischer	12-566-120	Deep well plate with lid and seal with Parafilm
Polypropylene microtiter plate		Fischer	12-566-120
HTS Filter plate		Millipore	MSBVN1B50
Ultralink Immobilized Protein A/G		Pierce	53133 (10ml)
Renilla Luciferase Assay System		Promega	E2820	For 2000 assays
Centro microplate luminometer		Berthold	LB 960