Isolatie en zuivering van Drosophila Perifere neuronen door Magnetic Bead sorteren
Summary
In deze video-artikel stellen we een methode voor de isolatie en zuivering van<em> Drosophila</em> Perifere neuronen met behulp van een snelle magnetische kraal bijgestaan celsortering strategie. RNA verkregen uit de geïsoleerde cellen kunnen gemakkelijk worden gebruikt voor downstream-toepassingen zoals microarray-analyses.
Abstract
De<em> Drosophila</em> Perifere zenuwstelsel (PNS) is een krachtig model voor het onderzoeken van de complexe processen van neuronale ontwikkeling en dendrieten morfogenese bij de functionele en moleculair niveau. Om te helpen in deze analyses, hebben wij een strategie ontwikkeld voor de isolatie van een subklasse van PNS neuronen genaamd dendritische arborization (da) neuronen die op grote schaal gebruikt voor het bestuderen van dendriet morfogenese<sup> 1,2</sup>. Deze neuronen zijn zeer moeilijk te isoleren als een zuivere populatie, mede door hun extreem lage optreden en hun moeilijk te bereiken locatie onder de stoere chitinous larvale cuticula. Onze nieuw ontwikkelde methode overwint deze uitdagingen, en is gebaseerd op een snelle en specifieke cel verrijking met behulp van antilichaam-gecoate magnetische korrels. Voor onze magnetische kraal sorteren studies, hebben we gebruik gemaakt van dezelfde leeftijd derde instar larven uiten van een muis CD8 gelabeld GFP fusie-eiwit (<em> UAS-mCD8-GFP</em>)<sup> 3</sup> Onder de controle van zowel de klasse IV dendritische arborization (da) neuron-specifieke<em> Zakkenroller (PPK)-GAL4</em> Driver<sup> 4</sup> Of de controle van het pan-da neuron-specifieke GAL4<sup> 21-7</sup> Driver<sup> 5</sup>. Hoewel dit protocol is geoptimaliseerd voor het isoleren van PNS-cellen, die zijn bevestigd aan de binnenwand van de larvale cuticula, door het variëren van een paar parameters, zou hetzelfde protocol gebruikt worden om veel verschillende soorten cellen aan de cuticula op larve of popstadium stadia van isoleren ontwikkeling (bijvoorbeeld epitheel, spier, oenocytes enz.), of andere celtypen uit larvale organen afhankelijk van de GAL4-specifieke driver expressie patroon. Het RNA geïsoleerd door deze methode is van hoge kwaliteit en kunnen gemakkelijk worden gebruikt voor de downstream-genomische analyses, zoals microarray genexpressie studies. Deze aanpak biedt een krachtige nieuwe tool om studies uit te voeren op geïsoleerde<em> Drosophila</em> Dendritische arborization (da) neuronen waardoor het verstrekken van nieuwe inzichten in de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen dendriet morfogenese.
Protocol
Discussion
Het protocol hier gepresenteerde is geoptimaliseerd voor de isolatie en zuivering van de perifere neuronen die strak te houden aan de binnenkant van de Drosophila derde instar larven nagelriemen met behulp van een magnetisch bolletje celsortering strategie. Hoewel we hebben gebruikt dit protocol om specifiek Drosophila da neuronen, toepassingen van dit protocol te isoleren om het isolement van andere celtypen die voldoen aan de cuticula in larve-of popstadium stadia van ontwikkeling (bijvoorbeeld epitheel, spieren, ande…
Acknowledgements
Wij danken Drs. Yuh-Nung Jan en Wes Grueber voor het aanbieden van vliegen voorraden die in deze studie. De auteurs erkennen de Thomas F. en Kate Miller Jeffress Memorial Trust voor de ondersteuning van dit onderzoek (DNC) en de George Mason University Provost's Office (EPRI).
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | MP Bioproducts | PBS10X02 | Diluted to 1X working solution | |
| 10X Liberase Blendzyme 3 | Roche | 11814176001 | Diluted to 1X working solution (28 Wünsch units/vial) | |
| RNase-AWAY | Sigma-Aldrich | 83931 | ||
| Biotinylated Rat anti-Mouse-CD8a antibody | Invitrogen | MCD0815 | 100 μg/ml stock concentration | |
| BSA (Bovine Serum Albumin), Fraction V | GibcoBRL | 11018-017 | Prepare a 1% BSA solution in PBS | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | 11205D | 1 μl can bind 0.05-0.10 μg of biotinylated antibody | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Molecular Devices | KIT0204 | Follow manufacturer’s instructions |
Equipment
- (10) Neodymium block magnets (K & J Magnetics, Inc., Cat. #B444B), alternatively DynaMag™-2 (Invitrogen, Cat. #123-21D) may be used.
- Kontes Glass Tissue Grinder, 2 ml working capacity, with large clearance pestle (Cat. #885300-0002)
- Cell filters, e.g. MACS Pre-Separation Filter (Miltenyi Biotec, Cat. #130-041-407)
- 35 mm petri-dishes coated with Sylgard (Dow Corning Corporation, Cat. #3097358-1004)
- Dissecting tools: two pairs of Dumont No. 5 forceps (Fine Science Tools, Cat. #11251-20)
- Vannas spring micro-dissection scissors (Fine Science Tools, Cat. #15000-08)
- Pipettes (P-1000, P-100, P-10) with disposable tips
- Standard hemocytometer to count the cells and estimate purity
- Pasteur pipettes with fire polished tips of standard diameter, narrowed to ~50% of standard diameter and narrowed to ~25% of standard diameter for trituration
- Table top micro-centrifuge (1-16,000 (x) g)
- Vortex
- Fluorescent stereo-microscope (a Leica MZ16FA was used in this protocol)
Referências
- Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136, 1049-1061 (2009).
- Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim, ., Jan, Y. N. Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields. Ann. Rev. Neurosci. 30, 399-423 (2007).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22, 451-461 (1999).
- Grueber, W. B. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134, 55-64 (2007).
- Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 5199-5204 (2007).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) methods. Methods. 25, 402-408 (2001).
