के अलगाव और शुद्धीकरण ड्रोसोफिला परिधीय न्यूरॉन्स चुंबकीय मनका छंटनी द्वारा
Summary
इस वीडियो लेख में हम अलगाव और शुद्धि के लिए एक विधि प्रस्तुत<em> ड्रोसोफिला</em> परिधीय न्यूरॉन्स एक तेजी से चुंबकीय मनका सहायता सेल छँटाई रणनीति का उपयोग कर. अलग कक्षों से प्राप्त शाही सेना माइक्रोएरे विश्लेषण सहित डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए आसानी से इस्तेमाल किया जा सकता है.
Abstract
<em> ड्रोसोफिला</em> परिधीय तंत्रिका तंत्र (पीएन) neuronal और कार्यात्मक और आणविक स्तर पर dendrite morphogenesis विकास की जटिल प्रक्रियाओं की जांच के लिए एक शक्तिशाली मॉडल है. इन विश्लेषण में सहायता करने के लिए, हम वृक्ष के समान (दा) arborization न्यूरॉन्स कि व्यापक रूप से dendrite morphogenesis के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया है बुलाया पीएन न्यूरॉन्स की एक subclass के अलगाव के लिए एक रणनीति विकसित किया है<sup1,2></sup>. ये न्यूरॉन्स बहुत एक शुद्ध जनसंख्या के रूप में अलग करना मुश्किल है, उनके बेहद कम घटना के भाग में कारण और उनके कठिन chitinous लार्वा छल्ली नीचे स्थान मुश्किल तक पहुँचने. हमारी नव विकसित विधि इन चुनौतियों पर काबू, और एक तेजी से और विशिष्ट कक्ष संवर्धन एंटीबॉडी लेपित चुंबकीय मोतियों का उपयोग पर आधारित है. हमारे चुंबकीय मनका छँटाई अध्ययन के लिए, हम उम्र से मिलान तीसरे instar लार्वा का इस्तेमाल किया है एक माउस CD8 टैग GFP संलयन प्रोटीन व्यक्त (<em> यूएएस mCD8 – GFP</em>)<sup> 3</sup> या तो चतुर्थ श्रेणी वृक्ष के समान arborization के नियंत्रण के तहत (दा) न्यूरॉन विशेष<em> (Ppk) जेबकतरा GAL4</em> ड्राइवर<sup> 4</sup> या पैन दा GAL4 न्यूरॉन विशेष का नियंत्रण<sup21-7></sup> ड्राइवर<sup> 5</sup>. हालांकि इस प्रोटोकॉल पीएन कोशिकाओं जो लार्वा छल्ली के भीतर दीवार से जुड़ी कुछ मापदंडों अलग से अलग करने के लिए ऑप्टिमाइज़ किया गया है, एक ही प्रोटोकॉल के लिए कई अलग अलग सेल प्रकार के लार्वा या pupal चरणों में छल्ली से जुड़ी को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता विकास (जैसे epithelia, मांसपेशियों, oenocytes आदि), या अन्य प्रकार की कोशिकाओं के लार्वा GAL4 ड्राइवर विशिष्ट अभिव्यक्ति पैटर्न के आधार पर अंगों से. इस विधि द्वारा अलग शाही सेना के रूप में उच्च गुणवत्ता की है और जीन अभिव्यक्ति रूपरेखा अध्ययन जैसे बहाव जीनोमिक विश्लेषण के लिए आसानी से इस्तेमाल किया जा सकता है. इस दृष्टिकोण पृथक पर अध्ययन करने के लिए एक नया शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है<em> ड्रोसोफिला</em> वृक्ष के समान arborization (दा) जिससे आणविक dendrite morphogenesis अंतर्निहित तंत्र में उपन्यास अंतर्दृष्टि प्रदान न्यूरॉन्स.
Protocol
Discussion
यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल और परिधीय न्यूरॉन्स जो ड्रोसोफिला तृतीय instar लार्वा एक चुंबकीय मनका सेल छँटाई की रणनीति का उपयोग छल्ली की भीतरी सतह को कस पालन करने के अलगाव और शुद्धि के लिए अनुकूलित है. जब तक हम…
Acknowledgements
हम डीआरएस धन्यवाद. Yuh-Nung जनवरी और मक्खी इस अध्ययन में इस्तेमाल शेयरों प्रदान करने के लिए वेस Grueber. लेखक थॉमस एफ और केट मिलर इस शोध के समर्थन के लिए Jeffress मेमोरियल ट्रस्ट (DNC) और जॉर्ज मेसन विश्वविद्यालय के प्रोवोस्ट के कार्यालय (EPRI) को स्वीकार करते हैं.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | MP Bioproducts | PBS10X02 | Diluted to 1X working solution | |
| 10X Liberase Blendzyme 3 | Roche | 11814176001 | Diluted to 1X working solution (28 Wünsch units/vial) | |
| RNase-AWAY | Sigma-Aldrich | 83931 | ||
| Biotinylated Rat anti-Mouse-CD8a antibody | Invitrogen | MCD0815 | 100 μg/ml stock concentration | |
| BSA (Bovine Serum Albumin), Fraction V | GibcoBRL | 11018-017 | Prepare a 1% BSA solution in PBS | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | 11205D | 1 μl can bind 0.05-0.10 μg of biotinylated antibody | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Molecular Devices | KIT0204 | Follow manufacturer’s instructions |
Equipment
- (10) Neodymium block magnets (K & J Magnetics, Inc., Cat. #B444B), alternatively DynaMag™-2 (Invitrogen, Cat. #123-21D) may be used.
- Kontes Glass Tissue Grinder, 2 ml working capacity, with large clearance pestle (Cat. #885300-0002)
- Cell filters, e.g. MACS Pre-Separation Filter (Miltenyi Biotec, Cat. #130-041-407)
- 35 mm petri-dishes coated with Sylgard (Dow Corning Corporation, Cat. #3097358-1004)
- Dissecting tools: two pairs of Dumont No. 5 forceps (Fine Science Tools, Cat. #11251-20)
- Vannas spring micro-dissection scissors (Fine Science Tools, Cat. #15000-08)
- Pipettes (P-1000, P-100, P-10) with disposable tips
- Standard hemocytometer to count the cells and estimate purity
- Pasteur pipettes with fire polished tips of standard diameter, narrowed to ~50% of standard diameter and narrowed to ~25% of standard diameter for trituration
- Table top micro-centrifuge (1-16,000 (x) g)
- Vortex
- Fluorescent stereo-microscope (a Leica MZ16FA was used in this protocol)
Referências
- Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136, 1049-1061 (2009).
- Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim, ., Jan, Y. N. Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields. Ann. Rev. Neurosci. 30, 399-423 (2007).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22, 451-461 (1999).
- Grueber, W. B. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134, 55-64 (2007).
- Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 5199-5204 (2007).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) methods. Methods. 25, 402-408 (2001).
