Флуоресценция Активированный сортировки клеток растений Протопласты
Summary
Метод выделения специфические типы клеток из растительного сырья демонстрируется. Эта техника работает трансгенных линий маркера выражения флуоресцентных белков, в частности, типы клеток, клеточной диссоциации и флуоресценции Активированный сортировки клеток. Кроме того, рост установки устанавливается здесь, что облегчает лечение<em> Arabidopsis thaliana</em> Рассады до сортировки клеток.
Abstract
Высокое разрешение, типа клеток конкретных анализ экспрессии генов значительно усиливает понимание развития, регулирования и ответов на стимулы окружающей среды в любой многоклеточного организма. В гибридизация и визуализации репортер ген может в ограниченной степени использоваться для этой цели, но для высокого разрешения количественных RT-PCR или высокой пропускной транскриптома всей анализ изоляции РНК из отдельных типов клеток является необходимой. Сотовая диссоциация ткани выражения флуоресцентного маркера белка в определенный тип клеток и последующее флуоресценции Активированный сортировки клеток (FACS) позволяет собрать достаточное количество материала для выделения РНК, кДНК анализа синтеза / усиления и микрочипов.
Обширный набор типа клеток конкретных флуоресцентных линий репортер доступна для научного сообщества растений. В этом случае два маркера линий Arabidopsis thaliana корень используются: P SCR:: GFP (эндодермы и покоя в центре) и P WOX5:: GFP (в состоянии покоя в центре). Большое количество (тысячи) рассаду выращивают гидропоники или на чашках с агаром и собирается получить достаточно материала, корневой для дальнейшего анализа. Сотовая диссоциации растительного материала достигается за счет ферментативного переваривания клеточной стенки. Эта процедура пользуется высокой осмолярности вызванных плазмолиза и коммерчески доступных целлюлазы, пектиназы и hemicellulases выпустить протопластов в раствор.
СУИМ из GFP-положительных клеток использует визуализации зеленых против красного спектра излучения протопластов возбуждаются 488 нм лазер. GFP-положительных протопластов можно отличить по их повышенной отношение зеленого до красного излучения. Протопластов, как правило, сортируется непосредственно в буфере добычи РНК и хранить для дальнейшей обработки на более позднее время.
Этот метод показан, чтобы быть простым и эффективным. Кроме того, показано, что она может быть использована без труда выделить достаточное количество клеток для транскриптом анализа, даже при очень скудных типов клеток (например, покоящихся клеток в центре). Наконец, рост установка для Arabidopsis саженцев Показано, что дает возможность лечения неосложненной растений до сортировки клеток (например, для типа клеток конкретного анализа биотических или абиотических ответы стресса). Потенциальные дополнительные использует для FACS растительных протопластов обсуждаются.
Protocol
Discussion
Протопласты могут, в принципе, быть получены из различных растительных тканей, оптимизации благоприятных условий значительно повысит РНК качество и количество. Оба protoplasting решения и выборные буфера инкубации использоваться будет влиять на этот аспект.
Много разных флу…
Acknowledgements
Работа выполнена при поддержке Национального научного фонда (грант №. DBI 0519984) и Национального института здоровья (грант №. 5R01GM078279) ..
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 250 μm nylon mesh | Sefar Filtration | NITEX 03-250/50 | ||
| 100 μm nylon mesh | Sefar Filtration | NITEX 03-100/47 | ||
| Square petri dishes | Fisher Scientific | 08-757-10k | ||
| Phytatrays | Sigma | P1552 | ||
| Murashige and Skoog Basal Medium (MS) | Sigma | M5519 | ||
| sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | ||
| MES | Sigma | M2933 | ||
| KOH | Sigma | P1767 | 10 M stock | |
| Eclipse 90i microscope | Nikon | |||
| Cellulase R-10 | Yakult Pharmaceutical | |||
| Macerozyme R-10 | Yakult Pharmaceutical | |||
| D-mannitol | Sigma | M9546 | ||
| KCl | Sigma | P8041 | 1 M stock | |
| BSA | Sigma | A3912 | ||
| β-mercaptoethanol | CALBIOCHEM | 444203 | ||
| CaCl2 | Sigma | C2536 | 1 M stock | |
| orbital shaker | LAB-LINE | |||
| 40 μm cell strainer | BD Falcon | 352340 | ||
| conical 15 ml tubes | BD Falcon | 352196 | ||
| table centrifuge | Sorvall | Legend RT | ||
| NaCl | Sigma | S3014 | ||
| FACSAria | BD | |||
| 1.5 ml microfuge tubes | VWR | 20170-38 | ||
| RNeasy micro kit | QIAGEN | 74004 | ||
| WT-Ovation Pico RNA Amplification System | NuGEN | 3300_12 | ||
| FL-Ovation cDNA Biotin Module V2 | NuGEN | 4200_12 |
Referências
- Sheen, J. Signal transduction in maize and Arabidopsis mesophyll protoplasts. Plant Physiol. 127, 1466-1475 (2001).
- Wysocka-Diller, J. W., Helariutta, Y., Fukaki, H., Malamy, J. E., Benfey, P. N. Molecular analysis of SCARECROW function reveals a radial patterning mechanism common to root and shoot. Development. 127, 595-603 (2000).
- Blilou, I., Xu, J., Wildwater, M., Willemsen, V., Paponov, I., Friml, J., Heidstra, R., Aida, M., Palme, K., Scheres, B. The PIN auxin efflux facilitator network controls growth and patterning in Arabidopsis roots. Nature. 433, 39-44 (2005).
- Gifford, M. L., Dean, A., Gutierrez, R. A., Coruzzi, G. M., Birnbaum, K. D. Cell-specific nitrogen responses mediate developmental plasticity. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 803-808 (2008).
- Bargmann, B. O. R., Birnbaum, K. D. Positive fluorescent selection permits precise, rapid, and in-depth overexpression analysis in plant protoplasts. Plant Physiol. 149, 1231-1239 (2009).
- Petersson, S. V., Johansson, A. I., Kowalczyk, M., Makoveychuk, A., Wang, J. Y., Moritz, T., Grebe, M., Benfey, P. N., Sandberg, G., Ljung, K. An Auxin Gradient and Maximum in the Arabidopsis Root Apex Shown by High-Resolution Cell-Specific Analysis of IAA Distribution and Synthesis. Plant Cell. 21, 1659-1668 (2009).
