Fluorescenza separazione delle cellule attivate delle protoplasti impianto
Summary
Un metodo per isolare specifici tipi cellulari da materiale vegetale è dimostrata. Questa tecnica utilizza le linee marcatore transgenici che esprimono proteine fluorescenti in particolari tipi di cellule, cellulari dissociazione e fluorescenza separazione delle cellule attivate. Inoltre, una configurazione di crescita è stabilito qui che facilita il trattamento delle<em> Arabidopsis thaliana</em> Piantine prima della separazione delle cellule.
Abstract
Ad alta risoluzione, il tipo specifico di cellule analisi dell'espressione genica migliora notevolmente la comprensione della regolazione dello sviluppo e delle risposte agli stimoli ambientali in ogni organismo multicellulare. Ibridazione in situ e la visualizzazione gene reporter può entro certi limiti essere utilizzate a tal fine, ma per alta risoluzione quantitativa RT-PCR o high-throughput a livello di analisi del trascrittoma l'isolamento di RNA da particolari tipi di cellule è necessaria. Dissociazione del tessuto cellulare che esprime un marcatore fluorescente proteina in un tipo cellulare specifico e successivo ordinamento fluorescenza cellulare attivato (FACS) permette di raccogliere quantità sufficienti di materiale per l'estrazione di RNA, cDNA analisi sintesi / amplificazione e microarray.
Un ampio insieme di cellule tipo-specifici linee giornalista fluorescente è disponibile alla comunità di ricerca delle piante. In questo caso, due linee marcatore della radice Arabidopsis thaliana sono utilizzati: P SCR:: GFP (endoderma e centro quiescente) e P WOX5:: GFP (centro di riposo). Un gran numero (migliaia) di piantine sono cresciute idroponica o su piastre di agar e raccolte di ottenere abbastanza materiale radice per ulteriori analisi. Cellulari dissociazione di materiale vegetale è ottenuta per digestione enzimatica della parete cellulare. Questa procedura si avvale di alta osmolarità indotta plasmolysis e cellulasi disponibili in commercio, pectinasi e emicellulasi di rilasciare protoplasti in soluzione.
FACS di cellule GFP-positive si avvale della visualizzazione del verde rispetto al rosso di spettri di emissione protoplasti eccitati da un laser a 488 nm. GFP-positive protoplasti si distinguono per il loro rapporto è aumentato di verde al rosso di emissioni. Protoplasti sono generalmente ordinati direttamente nel tampone di estrazione di RNA e conservati per l'ulteriore elaborazione in un secondo momento.
Questa tecnica si rivela essere semplice e praticabile. Inoltre, è dimostrato che può essere usata senza difficoltà per isolare un numero sufficiente di cellule per l'analisi del trascrittoma, anche per tipi di cellule molto scarse (ad esempio le cellule quiescenti centro). Infine, una messa a punto di crescita per piantine di Arabidopsis è dimostrato che permette di trattare semplice delle piante prima della separazione delle cellule (ad esempio per il tipo specifico di cellule analisi delle risposte di stress biotici e abiotici). Supplementari potenziali usi per FACS di protoplasti vegetali sono discussi.
Protocol
Discussion
Protoplasti può, in linea di principio, derivato da una varietà di tessuti vegetali, ottimizzando le condizioni favorevoli permetterà di migliorare notevolmente la qualità e la quantità di RNA. Sia la soluzione protoplasting e il buffer di incubazione elettiva utilizzati influenzano questo aspetto.
Molte diverse proteine fluorescenti possono essere utilizzati, a seconda delle capacità del FACS utilizzato, ad esempio, GFP, RFP, YFP, CFP o le loro varianti e derivati. L…
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Science Foundation (Grant no. DBI 0.519.984) e il National Institutes of Health (Grant no. 5R01GM078279) ..
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 250 μm nylon mesh | Sefar Filtration | NITEX 03-250/50 | ||
| 100 μm nylon mesh | Sefar Filtration | NITEX 03-100/47 | ||
| Square petri dishes | Fisher Scientific | 08-757-10k | ||
| Phytatrays | Sigma | P1552 | ||
| Murashige and Skoog Basal Medium (MS) | Sigma | M5519 | ||
| sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | ||
| MES | Sigma | M2933 | ||
| KOH | Sigma | P1767 | 10 M stock | |
| Eclipse 90i microscope | Nikon | |||
| Cellulase R-10 | Yakult Pharmaceutical | |||
| Macerozyme R-10 | Yakult Pharmaceutical | |||
| D-mannitol | Sigma | M9546 | ||
| KCl | Sigma | P8041 | 1 M stock | |
| BSA | Sigma | A3912 | ||
| β-mercaptoethanol | CALBIOCHEM | 444203 | ||
| CaCl2 | Sigma | C2536 | 1 M stock | |
| orbital shaker | LAB-LINE | |||
| 40 μm cell strainer | BD Falcon | 352340 | ||
| conical 15 ml tubes | BD Falcon | 352196 | ||
| table centrifuge | Sorvall | Legend RT | ||
| NaCl | Sigma | S3014 | ||
| FACSAria | BD | |||
| 1.5 ml microfuge tubes | VWR | 20170-38 | ||
| RNeasy micro kit | QIAGEN | 74004 | ||
| WT-Ovation Pico RNA Amplification System | NuGEN | 3300_12 | ||
| FL-Ovation cDNA Biotin Module V2 | NuGEN | 4200_12 |
Referências
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