Fabricación y operación de una inserción de oxígeno para Adherente cultivos celulares

Summary

Fabricación y validación de una plataforma de extensión que ofrece un mayor control sobre la oxigenación espacial y temporal en una placa de 6 pocillos. El dispositivo se adapta a una serie de sistemas de cultivo y se puede utilizar para investigar los efectos del oxígeno en la cicatrización de heridas.

Abstract

El oxígeno es un modulador clave de muchas vías celulares, pero permitiendo que los dispositivos actuales<em> In vitro</emModulación> oxígeno no cumplen con las necesidades de la investigación biomédica. La cámara de hipoxia ofrece un sistema simple de control de la oxigenación en los recipientes de cultivo estándar, pero carece de un control preciso temporal y espacial en la concentración de oxígeno en la superficie celular, impidiendo su aplicación en el estudio de una variedad de fenómenos fisiológicos. Otros sistemas han mejorado la cámara de hipoxia, pero requieren un conocimiento especializado y equipos para su funcionamiento, por lo que intimidante para el investigador promedio. Una inserción microfabricated de placas multipocillo ha sido desarrollado para controlar más eficazmente la concentración de oxígeno temporal y espacial de los fenómenos fisiológicos encontrado mejor modelo<em> In vivo</em>. La plataforma consta de una inserción de polidimetilsiloxano que anida en un estándar de la placa de pocillos múltiples, y sirve como una red de gas pasivo de microfluidos con una membrana permeable al gas destinado a modular la entrega de oxígeno a las células adherentes. El dispositivo es fácil de usar y está conectado a cilindros de gas que proporcionan la presión para introducir la concentración de oxígeno deseada en la plataforma. Fabricación consiste en una combinación de SU-8 estándar de fotolitografía, piezas de fundición de réplica, y se define PDMS girando sobre una oblea de silicio. Los componentes del dispositivo se unen después de un tratamiento superficial con un sistema de plasma de mano. La validación se realiza con un sensor de oxígeno fluorescentes planas. Tiempo de equilibrio es del orden de minutos y una amplia variedad de perfiles de oxígeno puede ser alcanzado a partir del diseño del dispositivo, como el perfil cíclico alcanzado en este estudio, e incluso los gradientes de oxígeno para imitar las que se encuentran<em> In vivo</em>. El dispositivo puede ser esterilizado para el cultivo celular utilizando métodos comunes, sin pérdida de la función. El dispositivo de aplicación al estudio de la<em> In vitro</emHerida> respuesta de curación se ha demostrado.

Protocol

1. Dispositivo de función El dispositivo de inserción de hipoxia contiene 6 pilares que anidan en un estándar de 6 pocillos. Los flujos de gas en la columna, a través de una red de microfluidos en la base de la columna, y fluye de vuelta fuera del dispositivo. En la base de la columna que forman la pared del fondo del microcanal es de 100 micras de espesor de gas permeable membrana de PDMS que permite la difusión de oxígeno entre el gas de microcanal y los medios de cultivo. De este modo, el dispositivo funciona mediante el establecimiento de un gradiente de concentración que impulsa la concentración de oxígeno hacia los medios de comunicación un valor deseado. El dispositivo ofrece una serie de ventajas frente a la cámara de hipoxia y otros sistemas de oxigenación celular: 1) reduce al mínimo la trayectoria de difusión de oxígeno que permite el control temporal rápido, 2) mejora el control espacial sobre la oxigenación, ya que depende del diseño del pilar de microcanales, 3) posee una una huella más pequeña de laboratorio y un mayor rendimiento para aumentar la eficiencia experimental, y 4) se adapta a las herramientas comunes de cultivo celular (por ejemplo, la placa de pocillos múltiples) sin necesidad de conocimientos especializados y el equipo. 2. Fabricación de los dispositivos Primer pilar de la matriz es réplica de moldeado con PDMS en un molde previamente Delran mecanizado. A continuación, el gas de microcanales en la parte inferior de cada pilar se fabrica utilizando estándar de SU-8 fotolitografía y moldeado PDMS réplica. El gas de membrana, es fabricado por giro definido de PDMS sobre una oblea de silicio para lograr el espesor deseado. En este ejemplo se utiliza una membrana de 100 micras de espesor que ha sido fabricado por girar 500 rpm durante 10 segundos y 900 rpm durante 30 segundos. Todos los componentes están unidos entre sí después del tratamiento con oxígeno de plasma con un dispositivo de plasma portátil (modelo BD-20, Electro-Técnica de Productos). 3. Instalación de dispositivos Suavemente inserte el dispositivo en la placa, asegurándose de que no queden burbujas. Inclinando el dispositivo durante la inserción ayuda a expulsar las burbujas de un lado. Por real basados ​​en células experimentos, este paso se debe hacer dentro de una campana de flujo laminar estéril. Las posibilidades de que la contaminación se reducen considerablemente una vez que el dispositivo se inserta, por lo que el montaje se puede llevar a la incubadora en un ambiente no estéril. Conecte el tubo del depósito de gasolina de origen a los puertos de entrada y salida del dispositivo. Para los experimentos basados ​​en células, la incubadora de la cultura debe tener un agujero para permitir la entrada tubo y el tubo debe ser conectado después de llevar el dispositivo y ponerlo en la incubadora. Tenga cuidado de no poner un exceso de presión en el dispositivo, lo que podría deformar el PDMS para aplastar a las células subyacentes. Asegúrese de que el regulador de flujo de precisión se cierra antes de abrir la tapa del tanque regulador para evitar el desbordamiento del dispositivo. Iniciar el flujo de gas. Suavemente precisión abrir el regulador de flujo de caudal deseado (50-100 ml / min). Ver el valor de cerca durante la siguiente hora y hacer los ajustes necesarios, ya que la caída de presión va a cambiar mientras el sistema se equilibra, alterando la velocidad de flujo. Para evitar la formación de burbujas en los medios de comunicación, reducir el caudal de entre 10-20 ml / min después de una inicial de 15 minutos duración del equilibrado con el caudal más alto. Después de duración deseada experimental, detener el flujo de gas, quitar la placa, y las células de proceso en consecuencia (por ejemplo, lisar, mancha, cuenta, etc.) 4. Dispositivo de validación Calibración Seleccione el número y la ubicación de las posiciones en el oxígeno fluorescentes (FOXY) sensor de deslizamiento (en función de los requisitos de validación) que será utilizado para la medición de oxígeno. La diapositiva contiene una capa de rutenio tinte fluorescente que se apaga por el oxígeno. Exponer de diapositivas directamente a 0, 10 y 21% de oxígeno del tanque de gas y la captura de imágenes después de 5 minutos para el equilibrio adecuado. Exportar la intensidad de la imagen significa que para cada puesto y la concentración de la oxigenación trama que depende de la intensidad fluorescente. Generar la curva de calibración mediante el ajuste de las curvas lineales de la línea 00-10% y 10-21% de línea. Heterogeneidad Establecer múltiples puntos que abarca el ancho del canal en un intervalo definido (por ejemplo, cada 1 mm). Tenga en cuenta que puede haber superposición de imágenes en función de la distancia. Medir la concentración de oxígeno en la superficie, así a través del dispositivo Equilibrio Elija tres puntos en la diapositiva en la que FOXY para medir la concentración de oxígeno. Inmediatamente después de la captura de una imagen por primera vez en los niveles de oxígeno en el ambiente, abra el regulador de flujo de precisión para iniciar el flujo de gas en el dispositivo. Capturar imágenes a intervalos apropiados para evaluar la duración y el alcance de Concentr oxígenoción de equilibrio (por ejemplo, cada 10 segundos durante 30 minutos). 5. Aplicaciones Curación de Heridas Un día antes del experimento, tomar la esterilización insertar PDMS en medio libre de suero para reducir el inhibir la formación de burbujas de gas en el pozo. Las células de cultivo a 100% de confluencia en una placa de 6 pocillos. Crear arañazos directamente en las monocapas con una punta de pipeta p200 para simular heridas. Aspirar los medios de comunicación celular, lavar con 5 ml de medio, y aspirar de nuevo. Es importante no perturbar la monocapa de células. Rellenar los pozos con 4 ml medio libre de suero para reducir la proliferación celular. Lugar insertar en los pozos y conectar cada pocillo a una concentración de oxígeno correspondiente. Lugar de 6 pocillos con inserción en el escenario se calienta a 37 ° C. Capturar imágenes de lapso de tiempo de las células en el intervalo deseado y la duración total. T_Scratch MATLAB, un algoritmo de medición de la herida, se puede utilizar para analizar la superficie sin cicatrizar. 6. Resultados representante Dispositivo de validación El dispositivo de inserción de hipoxia presenta grandes mejoras en la cámara de hipoxia en términos de tiempo y el grado de equilibrio de oxígeno, lo que requiere menos de 2 minutos para estabilizar a un 0,5% de oxígeno. La membrana y el tamaño del dispositivo brecha final era el factor crítico para determinar la eficiencia de equilibrio, con tamaños más grandes diferencias que requieren más tiempo para alcanzar el estado de equilibrio los valores de concentración de oxígeno. El dispositivo también permite un gran control sobre la oxigenación espacial en un solo pozo, lo que permite la formación de varias condiciones, e incluso generar un perfil cíclico de oxígeno a través de la superficie del pozo. La curación de heridas Monocapas de células fueron expuestas al oxígeno del 10% o 21% y la superficie de la herida se analizó a través del tiempo. Rasguños expuestos a 21% de oxígeno cerrado el más lento y un 10% más rápido. La figura 1 muestra las imágenes de un rasguño en el transcurso de 17 horas. Los gráficos de la Figura 5 se muestra el porcentaje de área de la herida abierta, tanto para las concentraciones de oxígeno durante la duración del experimento. Figura 1. Esquemas y diagramas que ilustran las características del dispositivo. El dispositivo de inserción de oxígeno es fabricado por la fotolitografía convencional (red de microfluidos), piezas de fundición de réplica (de microfluidos red y andamios de inserción), y define giro de PDMS (permeables al gas de membrana). A) El dispositivo de oxígeno incluido dentro de una placa de 6 pocillos. B) Ejemplos de los 24 y 96 y las matrices columna. C) Una sección transversal esquemática de una columna. El oxígeno fluye hacia el dispositivo a través de la entrada y viaja a través de una red de microfluidos en la parte inferior de la columna. El oxígeno puede difundir libremente a través de la membrana permeable al gas PDMS en la parte inferior de la columna y se disuelven en el medio de cultivo. D) Una imagen de microscopio que muestra las diversas características de un pilar de un solo canal desde arriba, con los mensajes de vidrio en condiciones de servidumbre para los estudios de equilibrio. Figura 2. Validación del dispositivo con sensores de oxígeno. La tensión de oxígeno dentro de cada bien se caracterizó con un plano del sensor de oxígeno de rutenio. Todas las mezclas de oxígeno contenido de nitrógeno equilibrada y un 5% de CO 2 para amortiguar los medios de comunicación. A) Parcela que ilustra el efecto de la altura del poste, y por lo tanto la distancia de difusión de oxígeno entre la membrana y las células, en el tiempo de equilibrio y eficacia. Alturas fueron establecidos por los mensajes de cristal tallado con destino a la parte inferior del dispositivo. Los tres tamaños de rendimiento después de tiempos de equilibrio mejorado mucho en la cámara de hipoxia. Tenga en cuenta que el tiempo es en una escala logarítmica. B) Parcela que representa el rápido equilibrio de oxígeno el tiempo de respuesta del dispositivo de 0,2 mm de distancia. C) Multi-posición linescans También se tomaron todo el bien en el microcanal para asegurar la homogeneidad de la concentración de oxígeno introducido por el dispositivo. Gráfico muestra la concentración de oxígeno medida después de la infusión de 0%, 10% y 21% de oxígeno durante 10 minutos. D) El dispositivo mantiene efectivamente un 10% de oxígeno en 5 días. Figura 3. La experimentación con diseños más complejos de oxígeno microcanales. A) la configuración de doble condición de microcanal produce una estabilidad del 0% y el 21% perfil de oxígeno durante 14 días. B) Un patrón interdigitados y la liquidación de 500 micras de ancho microcanales se extiende a través ªe los resultados pilar en un perfil cíclico de oxígeno. Tenga en cuenta que los datos sólo se muestra un ensayo representativo como la alineación de microcanal fue difícil. Figura 4. Timelapse imágenes del cierre de la herida 0, 7, y 17 horas después de la cero inicial. Las células fueron entregados 21% de oxígeno a lo largo de la duración del experimento. Figura 5. Efecto de la concentración de oxígeno en la tasa de cicatrización de la herida en un ensayo de cero.

Discussion

El dispositivo es fabricado por la norma SU-8 fotolitografía, piezas de fundición de réplica, y se define el hilado y hecho completamente de polidimetilsiloxano. El gas es introducido en el dispositivo para establecer un gradiente de concentración entre el pilar de microcanal y los medios de cultivo, manejo del sistema a una concentración de equilibrio de oxígeno deseado. El dispositivo se ha demostrado que efectivamente modulan la oxigenación temporal y espacial dentro de un pozo, así como modular el comportamiento celular apropiada. El patrón espacial de la oxigenación es definido por el microcanal en la base de la columna, por lo que una gran variedad de diseños podrían aplicarse en la elaboración de la fotomáscara. Además, la infusión del gas deseado en la fase de gas del pozo se espera que mejore el tiempo de equilibrio y el grado de hipoxia. Una red de mezcla de microfluidos podría ser adaptado para el dispositivo para proporcionar un medio para producir mezclas de gas de la novela sólo unos pocos tanques reservas de gas. Finalmente, un mecanismo de intercambio de medios que elimina la necesidad de retirar el dispositivo de la placa de pocillos múltiples, de las cuales las células pueden responder.

El dispositivo tiene aplicaciones en cualquier experimento in vitro o ex vivo que requiere el control de la concentración de oxígeno. Como el oxígeno es una importante variable fisiológica que afecta a un gran mayoría de las vías de señalización, las áreas de investigación que se beneficiarían está limitada por la creatividad del investigador. Algunos de los campos que se beneficiarían de un mayor control del temporal de la concentración de oxígeno incluyen la metástasis del cáncer, apnea del sueño, y la lesión cardiaca isquemia-reperfusión, entre muchos otros. Por ejemplo, la hipoxia intermitente se ha relacionado con cánceres más invasivos, upregulating una serie de metastastis asociada a los genes en relación con la hipoxia y normoxia continua. Control del espacio es también importante, ya que los gradientes de oxígeno son fundamentales para el desarrollo, la zonificación del hígado, la toxicidad del fármaco, y el nicho de células madre. El dispositivo se presenta en este artículo se benefician a un número de áreas de investigación, proporcionando un sistema con un tamaño más pequeño de laboratorio, las necesidades operativas relativamente simple, y un mayor control sobre la exposición al oxígeno a las células.

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
PDMS-Sylgard 184		Dow Corning
Planar FOXY sensor		Ocean Optics	FOXY-SGS-M	Coated microscope slide
Gas regulator		Omega	FL-1472-G
Gas		Airgas	Custom mixes	All have 5% CO2
SU-8 2150		Microchem
MDCK Growth Medium w/ L-Glutamine		SAFC Biosciences	M3803
Fetal Bovine Serum		ATCC	30-2020
Trypsin-EDTA		Sigma	T4049
L-Glutamine solution		Sigma	G7513