Herstellung und Betrieb eines Oxygen Insert für adhärente Zellkulturen

Summary

Herstellung und Validierung eines Add-on-Plattform, die eine verbesserte Kontrolle über die räumliche und zeitliche Sauerstoffzufuhr in ein 6-Well-Platte bietet. Das Gerät lässt sich an einer Reihe von Kultur-Systeme und kann verwendet werden, um die Wirkung von Sauerstoff auf die Wundheilung zu untersuchen.

Abstract

Sauerstoff ist ein wichtiger Modulator der vielen zellulären Signalwege, aber die aktuellen Geräte erlauben<em> In-vitro-</em> Sauerstoff-Modulation nicht auf die Bedürfnisse der biomedizinischen Forschung gerecht zu werden. Die hypoxischen Kammer bietet ein einfaches System zur Sauerstoffanreicherung in Standard-Kulturgefäße Kontrolle, aber es fehlt präzise zeitliche und räumliche Kontrolle über die Sauerstoff-Konzentration an der Zelloberfläche und verhindert so deren Anwendung bei der Untersuchung einer Vielzahl von physiologischen Erscheinungen. Andere Systeme sind auf die hypoxischen Kammer verbessert, sondern erfordern spezielle Kenntnisse und Ausrüstung für ihren Betrieb, so dass sie einschüchternd für den durchschnittlichen Forscher. Eine mikrostrukturierte Einsatz für Mikrotiterplatten wurde entwickelt, um besser steuern die zeitliche und räumliche Sauerstoffkonzentration auf besseres Modell physiologischen Erscheinungen gefunden<em> In vivo</em>. Die Plattform besteht aus einem Polydimethylsiloxan einzufügen, Nester in eine Standard-Mikrotiterplatte und dient als passive mikrofluidische Gasnetz mit einem Gas-durchlässige Membran zielte darauf ab, die Sauerstoffversorgung zu modulieren adhärenten Zellen. Das Gerät ist einfach zu bedienen und ist an Gasflaschen, dass der Druck auf die gewünschte Sauerstoffkonzentration in die Plattform vorstellen zu liefern. Fabrication beinhaltet eine Kombination von Standard-SU-8 Photolithographie, Replikat, und definierte PDMS Spinnen auf einem Silizium-Wafer. Die Komponenten des Geräts sind nach der Oberflächenbehandlung mit einem Hand-Plasma-System gebunden. Validation ist mit einer planaren fluoreszierenden Sauerstoff-Sensor erreicht. Gleichgewichtseinstellungszeit ist in der Größenordnung von Minuten und einer Vielzahl von Sauerstoff-Profile können auf dem Gerät Design, wie das zyklische Profil in dieser Studie erreicht und sogar Sauerstoff-Gradienten erreicht werden, um diese zu imitieren<em> In vivo</em>. Das Gerät kann für die Zellkultur sterilisiert werden mit üblichen Methoden, ohne Verlust der Funktion. Das Gerät ist Anwendbarkeit auf die Untersuchung der<em> In-vitro-</em> Wundheilung Reaktion nachgewiesen werden kann.

Protocol

1. Gerätefunktion Die hypoxische einfügen Gerät enthält 6-Säulen, Nest in einem Standard-6-Well-Platte. Gas strömt in die Säule, auf einem mikrofluidischen Netzwerk an der Basis der Säule, und fließt wieder aus dem Gerät. An der Basis der Säule bildet die untere Wand des Mikrokanals ist ein 100 um dick gasdurchlässige PDMS-Membran, die Sauerstoffdiffusion erlaubt zwischen dem Gas Mikrokanal und Kulturmedien. Somit arbeitet das Gerät durch die Errichtung eines Konzentrationsgradienten, dass die Medien Sauerstoffkonzentration Laufwerke zu einem gewünschten Wert ein. Das Gerät bietet eine Reihe von Vorteilen gegenüber dem hypoxischen Kammer und andere Zelle Sauerstoffzufuhr: 1) minimiert die Sauerstoffdiffusion Weg ermöglicht schnellere zeitliche Steuerung, 2) erhöht die räumliche Kontrolle über Sauerstoffversorgung, da abhängig von der Säule Mikrokanal Design, 3) besitzt eine kleinere Labors Stellfläche und einen höheren Durchsatz zu experimentellen Effizienz zu steigern, und 4) passt sich an gemeinsamen Zellkultur-Tools (zB Mikrotiterplatte), ohne die Forderung nach Fachwissen und Ausrüstung. 2. Bauelementherstellung Zunächst wird die Säule Array Replikat mit PDMS in einer zuvor bearbeiteten Delran Form geformt. Als nächstes werden die Gas-Mikrokanal am unteren Rand jeder Säule wird hergestellt unter Verwendung von Standard SU-8 Photolithographie und PDMS Replikat. Das Gas-durchlässige Membran ist definiert durch Spinnen von PDMS auf einem Silizium-Wafer auf die gewünschte Dicke erreicht hergestellt. In diesem Beispiel verwenden wir eine 100 um dicke Membran, die durch Schleudern 500 Umdrehungen pro Minute für 10 Sekunden und dann 900 rpm für 30 Sekunden hergestellt wurde. Alle Komponenten sind zusammen nach Sauerstoff-Plasma-Behandlung mit einem Handheld-Plasma-Gerät (Modell BD-20, Electro-Technic Products) gebunden. 3. Geräte-Setup Schieben Sie Gerät in die Platte, achten Sie darauf, Blasen zu vermeiden. Angling das Gerät beim Einstecken hilft, Blasen zu vertreiben aus einer Seite. Für aktuelle zellbasierten Experimenten, müssen Sie diesen Schritt in einem sterilen Laminarströmungshaube durchgeführt werden. Die Chancen für Verunreinigungen stark reduziert, wenn das Gerät eingelegt wird, so dass die Baugruppe über können in den Inkubator durchgeführt werden in einem nicht-sterilen Umgebung. Die Leitungen von der Quelle Gastank mit dem Einlass-und Auslasskanäle des Gerätes. Für zellbasierten Experimenten sollte der Inkubator ein Loch mit dem Schlauch die Einreise und den Schlauch sollte nach Durchführung des Geräts und stellen Sie es in den Inkubator angeschlossen werden zulassen. Achten Sie darauf, zu vermeiden, dass Überdruck auf dem Gerät, das die PDMS verformen könnte genug, um die darunter liegenden Zellen zu vernichten. Achten Sie darauf, die Präzision Durchflussregler vor dem Öffnen des Tank-Top Regler zu vermeiden überfüllt das Gerät geschlossen wird. Starten Sie den Gasstrom. Öffnen Sie vorsichtig Präzision Durchflussregler zur gewünschten Durchfluss (50-100 ml / min). Sehen Sie den Wert genau in den nächsten Stunden und nehmen Sie bei Bedarf, da der Druckabfall wird sich ändern, während das System im Gleichgewicht, Veränderung der Durchflussmenge. Zur Vermeidung der Bildung von Blasen in den Medien, reduzieren den Durchfluss zwischen 10-20 ml / min nach einer ersten 15 Minuten Äquilibrierung Dauer mit der höheren Fließgeschwindigkeit. Nach gewünschten Versuchsdauer, stop Gasstrom, entfernen Sie die Platte und Prozess-Zellen entsprechend (zB lysieren, Beize, zählen, etc.). 4. Geräte-Validierung Kalibrierung Wählen Sie die Anzahl und Lage der Positionen auf dem fluoreszierenden Sauerstoff (FOXY) Sensor schieben (abhängig von der Validierung Anforderungen), die für Sauerstoff-Messung verwendet werden. Die Folie enthält einen fluoreszierenden Ruthenium-Farbstoff-Beschichtung, die durch Sauerstoff gelöscht wird. Expose Bild direkt auf 0, 10 und 21% Sauerstoff aus Gastank und die Aufnahmen nach 5 Minuten für die richtige Gleichgewicht. Export der mittleren Bildintensität für jede Position und Plot Sauerstoffversorgung Konzentration abhängig Fluoreszenzintensität. Generieren Kalibrierkurve durch den Einbau lineare Kurven, die 0-10% Linie und 10-21% Linie. Heterogenität Richten Sie mehrere Punkte über die gesamte Breite des Kanals in einem definierten Intervall (zB alle 1 mm). Beachten Sie, dass es Überschneidungen der Bilder je nach Abstand werden. Messen Sie die Sauerstoffkonzentration an der Oberfläche auch durch die Einrichtung Äquilibrierung Wählen Sie drei Punkte auf dem FOXY Folie, in der die Sauerstoffkonzentration messen. Unmittelbar nach der Aufnahme ein erstes Bild bei Umgebungstemperatur Sauerstoff, öffnen Sie die Präzision Durchflussregler, um den Gasfluss in das Gerät zu starten. Aufnehmen von Bildern zu einem geeigneten, um die Dauer und das Ausmaß von Sauerstoff konzentr bewertenATION Gleichgewichts (z. B. alle 10 Sekunden für 30 min). 5. Anwendungen Wound Healing Einen Tag vor dem Experiment, genießen die sterilisierten PDMS einfügen in serum-freiem Medium zu reduzieren hemmen Gasblasenbildung in den Brunnen. Kultur-Zellen zu 100% Konfluenz in einer 6-Well-Platte. Erstellen Sie direkt Kratzer in der Monoschichten mit einem p200 Pipettenspitze, um Wunden zu simulieren. Saugen Sie die Zelle Medien, mit 5 ml Medium spülen und absaugen wieder. Es ist wichtig, nicht stören Monoschicht von Zellen. Füllen Sie den Brunnen mit 4 ml serum-freiem Medium, um die Zellproliferation zu reduzieren. Legen Sie in die Vertiefungen einzufügen und eine Verbindung jeweils auch eine entsprechende Sauerstoffkonzentration. Legen Sie 6-Well-Platte mit Einsatz auf beheizten Bühne bei 37 ° C. Erfassen Zeitreihen-Aufnahmen der Zellen im gewünschten Intervall und Gesamtdauer. MATLAB ist T_Scratch, eine Wunde Mess-Algorithmus kann verwendet werden, um die vernarbte Fläche zu analysieren. 6. Repräsentative Ergebnisse Geräte-Validierung Die hypoxische einfügen Gerät weist große Verbesserungen gegenüber dem hypoxischen Kammer in Bezug auf Sauerstoff Gleichgewichtszeit und Umfang, die weniger als 2 Minuten auf 0,5% Sauerstoff zu stabilisieren. Das Gerät Membran-und Unterseite Spaltmaß war der kritische Faktor bei der Bestimmung des Gleichgewichts Effizienz, mit größeren Spaltmaßen, die mehr Zeit, um steady-state Sauerstoffkonzentration Werte erreichen. Das Gerät ermöglicht auch ein hohes Maß an Kontrolle über die räumliche Sauerstoffzufuhr in einem einzigen, gut, so dass die Bildung von mehreren Bedingungen, und selbst erzeugen eine zyklische Sauerstoff-Profil über die Oberfläche des Brunnens. Die Wundheilung Zellmonoschichten wurden zu 10% oder 21% Sauerstoff und die Oberfläche der Wunde freigelegt wurde im Laufe der Zeit analysiert. Kratzer ausgesetzt zu 21% Sauerstoff schloss die langsamste und 10% der am schnellsten. Abbildung 1 zeigt Bilder eines Kratzers im Laufe von 17 Stunden. Die Diagramme in Abbildung 5 zeigen die Prozent der offenen Wundfläche sowohl für Sauerstoff-Konzentrationen für die Dauer des Experiments. Abbildung 1. Schaltplan und Diagramme, die Gerätefunktionen. Der Sauerstoff einfügen Gerät ist durch konventionelle Photolithographie (Mikrofluidik-Netzwerk), Replikat (Mikrofluidik-Netzwerk und legen Gerüst) hergestellt und definiert von PDMS Spinnen (Gas-Membran). A) Der Sauerstoff-Gerät in einem 6-Well-Platte verschachtelt. B) Beispiele 24 und 96-Well-Säule Arrays. C) Ein Querschnitt schematisch eine Säule. Sauerstoff strömt in das Gerät durch den Einlass und fährt über eine mikrofluidische Netzwerk an der Unterseite des Ständers. Sauerstoff kann frei über die gasdurchlässige PDMS Membran diffundieren am unteren Rand der Säule und lösen sich in den Kulturmedien. D) eine mikroskopische Aufnahme zeigt die verschiedenen Funktionen eines Single-Channel-Säule von oben, mit gebundenen Glas Beiträge für die Äquilibrierung Studien. Abbildung 2. Validierung der das Gerät mit Sauerstoff-Sensoren. Sauerstoff-Partialdruck in jeder Vertiefung wurde unter Verwendung eines planaren Ruthenium Sauerstoffsensor. Alle Sauerstoff-Gemischen enthaltenen ausgewogenen Stickstoff und 5% CO 2 für Medien-Pufferung. A) Darstellung, die die Wirkung der post Höhe, und damit Sauerstoffdiffusion Abstand zwischen der Membran und Zellen, auf die Gleichgewichtseinstellung und Effektivität. Heights wurden von geschliffenem Glas Beiträge verpflichtet, die Unterseite des Gerätes festgelegt. Alle drei post Größen ergeben Äquilibrierungszeiten viel über die hypoxischen Kammer verbessert. Beachten Sie, dass Zeit auf einer logarithmischen Skala ist. B) Plot Darstellung der schnellen Sauerstoff Equilibrierung Ansprechzeit des 0,2 mm Abstand Gerät. C) Multi-Position linescans wurden auch über die weit unter den Mikrokanal ergriffen, um die Homogenität der Sauerstoffkonzentration durch das Gerät eingeführt wurden. Graph zeigt die Sauerstoffkonzentration nach Infusion von 0%, 10% und 21% Sauerstoff für 10 min gemessen. D) Geräte effektiv hält 10% Sauerstoff über 5 Tage. Abbildung 3. Experimentieren mit komplexeren Sauerstoff Mikrokanal Designs. A) Dual-Zustand Mikrokanal Setup ergibt sich eine stabile 0% und 21% Sauerstoff-Profil über 14 Tage. B) Ein verzahnt und gewundenen Muster von 500 um Breite Mikrokanälen sich über the Säule ergibt sich eine zyklische Sauerstoff Profil. Beachten Sie, dass die Daten nur zeigt einen Vertreter Studie als Mikrokanal Ausrichtung war schwierig. Abbildung 4. Timelapse Bilder Wundverschluss 0, 7, und 17 Stunden nach der ersten Kratzer. Die Zellen wurden 21% Sauerstoff im gesamten Dauer des Experiments geliefert. Abbildung 5. Wirkung von Sauerstoff-Konzentration auf die Wundheilung Rate in einen Kratzer Assay.

Discussion

Das Gerät wird durch Standard-SU-8 Photolithographie, Replikat, und definiert Spinnen und ganz aus Polydimethylsiloxan gemacht hergestellt. Gas wird in das Gerät eingeführt, um einen Konzentrationsgradienten zwischen der Säule Mikrokanal und die Kultur Mittel herzustellen, fahren das System in Richtung eines gewünschten Gleichgewichts-Sauerstoff-Konzentration. Das Gerät hat sich gezeigt, um effektiv zu modulieren die zeitliche und räumliche Sauerstoffzufuhr in einem Brunnen, sowie modulieren zelluläre Verhalten angemessen. Die räumliche Strukturierung der Oxygenierung durch den Mikrokanal ist an der Basis der Säule definiert, so eine Vielzahl von Designs in Handarbeit die Photomaske umgesetzt werden könnten. Darüber hinaus ist die Infusion von der gewünschten Gas in die Gasphase der auch erwartet, dass Gleichgewichtszeit und das Ausmaß der Hypoxie zu verbessern. Ein mikrofluidischen Mischen Netzwerk könnte, um das Gerät angepasst werden, um ein Mittel bereitzustellen, um neue Gasgemische aus nur ein paar Lager Gastanks zu produzieren. Schließlich würde ein Mechanismus für Austausch von Medien überflüssig für die Entfernung des Geräts vom Multiwellplatte, von denen die Zellen reagieren.

Das Gerät verfügt über Anwendungen in allen in vitro oder ex vivo Experiment erfordert die Kontrolle über Sauerstoffkonzentration. Da Sauerstoff eine wichtige physiologische Variablen beeinflussen die überwiegende Mehrheit der Signalwege, die Bereiche Forschung, die profitieren würden durch die Kreativität des Forschers begrenzt. Einige Felder, die von der erweiterten zeitliche Steuerung der Sauerstoffkonzentration profitieren würde Krebsmetastasen, Schlafapnoe, und kardialen Ischämie Reperfusionsschaden, unter vielen anderen. Zum Beispiel hat intermittierende Hypoxie mit mehr invasiven Karzinomen korreliert, heraufregulierende eine Reihe von metastastis-assoziierter Gene in Bezug auf kontinuierliche Hypoxie und Normoxie. Räumliche Steuerung ist auch wichtig, wie Sauerstoff-Gradienten kritisch in der Entwicklung, Leber Zonierung, Drogen Toxizität und die Stammzell-Nische sind. Das Gerät in diesem Artikel vorgestellt werden eine Reihe von Bereichen der Forschung durch die Bereitstellung eines Systems mit einem kleineren Labor Stellfläche, relativ einfach, den operativen Bedarf und weit größere Kontrolle über die Sauerstoffsättigung, um Zellen zu profitieren.

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
PDMS-Sylgard 184		Dow Corning
Planar FOXY sensor		Ocean Optics	FOXY-SGS-M	Coated microscope slide
Gas regulator		Omega	FL-1472-G
Gas		Airgas	Custom mixes	All have 5% CO2
SU-8 2150		Microchem
MDCK Growth Medium w/ L-Glutamine		SAFC Biosciences	M3803
Fetal Bovine Serum		ATCC	30-2020
Trypsin-EDTA		Sigma	T4049
L-Glutamine solution		Sigma	G7513