Split-ubiquitine membrane à base de levure double hybride (MYTH) Système: Un outil puissant pour identifier les interactions entre protéines
Summary
MYTHE permet la détection sensible des interactions transitoires et stables entre les protéines qui sont exprimées dans l'organisme modèle Saccharomyces cerevisiae. Elle a été appliquée avec succès pour étudier exogènes et de la levure des protéines membranaires intégrales en vue d'identifier leurs partenaires d'interaction de façon à haut débit.
Abstract
L'importance biologique fondamentale et clinique de protéines membranaires intégrales conduit au développement d'un système à base de levure pour l'identification à haut débit des interactions protéine-protéine (PPI) pour les protéines transmembranaires pleine longueur. À cette fin, notre laboratoire a développé le split-ubiquitine levure membrane à base de double-hybride (MYTH) du système. Cette technologie permet la détection sensible des interactions protéiques transitoires et stables à l'aide<em> Saccharomyces cerevisiae</em> Comme un organisme hôte. MYTHE tire parti de l'observation que l'ubiquitine peut être séparé en deux moitiés stables: la moitié C-terminale de la levure ubiquitine (C<sub> UB</sub>) Et la moitié N-terminale de la fraction de l'ubiquitine (N<sub> UB</sub>). Dans le mythe, ce principe est adapté pour être utilisé comme un «capteur» des interactions protéine-protéine. En bref, la protéine membranaire intégrale appât est fusionnée à C<sub> UB</sub> Qui est lié à un facteur de transcription artificiels. Protéines proie, soit en format individuel ou de la bibliothèque, sont fusionnés à la N<sub> UB</sub> Fraction. Interaction protéine entre l'appât et proie conduit à la reconstitution de l'ubiquitine moitiés, formant une pleine longueur "pseudo-ubiquitine" molécule. Cette molécule est à son tour reconnu par les enzymes cytosoliques désubiquitination, résultant en un clivage du facteur de transcription, et l'induction subséquente de l'expression du gène rapporteur. Le système est hautement adaptable, et est particulièrement bien adapté pour criblage à haut débit. Elle a été employée avec succès pour étudier les interactions avec des protéines membranaires intégrales des deux levures et autres organismes.
Protocol
Discussion
Le mythe est le système de premier haut débit qui permet l'identification des interactions entre protéines membranaires pleine longueur et cytosoliques ou membranaires partenaires. Il a été utilisé pour étudier des protéines membranaires à partir d'un éventail d'organismes [3-7]. Il ya, cependant, les détails spécifiques qui peuvent avoir besoin d'être examinées attentivement pour s'assurer la protéine d'intérêt est susceptible d'étudier avec le mythe.
<p class="jove_con…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier Edmonds Dawn pour une lecture critique de ce manuscrit. Le laboratoire est soutenu par Stagljar fonds de la Fondation canadienne pour l'innovation (FCI), l'Institut canadien de recherche en santé du Canada (IRSC), la Fondation des maladies du cœur, la Société canadienne du cancer, et Novartis.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Polyethenlene Glycol (PEG3350) | Bioshop | PEG335 | ||
| Lithium Acetate Bihydrate | Bioshop | LIA001 | ||
| X-Gal (5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-b-D-galactopyranoside) | Bioshop | XGA001 | ||
| N`,N-dimethyl formamide | Bioshop | DMF 451 | ||
| 3-amino-1,2,4-triazole (3-AT) | Bioshop | ATT124 | ||
| Sodium phosphate dibasic | Bioshop | SPD307 | ||
| Sodium phosphate monobasic | FisherBiotech | BP329-500 | ||
| Salmon Sperm DNA | VWR | CA80601-120 | ||
| D-Glucose | Bioshop | GLU501 | ||
| LB Broth LENOX | Bioshop | LBL405 | ||
| Yeast Nitrogen Base | Bioshop | YNB406 | ||
| Yeast Extract | Bioshop | YEX401 | ||
| Peptone | Beckton Dickinson | 211677 | ||
| Bio-Tryptone | Bioshop | TRP402 | ||
| Adenine Sulphate | Bioshop | ADS201 | ||
| L-Uracil | Bioshop | URA241 | ||
| L-Threonine | Bioshop | THR002 | ||
| L-Histidine | Bioshop | HIS200 | ||
| L-Methionine | Bioshop | MET222 | ||
| L-Valine | Bioshop | VAL201 | ||
| L-Phenylalanine | Bioshop | PHA302 | ||
| L-Isoleucine | Bioshop | ISO910 | ||
| L-Tyrosine | Bioshop | TYR333 | ||
| L-Leucine | Bioshop | LEU222 | ||
| L-Arginine | Bioshop | ARG006 | ||
| L-Tryptophane | FisherBiotech | BP395-100 | ||
| L-Lysine | Bioshop | LYS101 | ||
| L-Alanine | FisherBiotech | BP369-100 | ||
| Agar | Bioshop | AGR001 | ||
| Soda Lime Galss Beads | BioSpec Product | 11079105 | ||
| Sodium Chloride | Bioshop | SLD002 |
Referências
- Stagljar, I., Fields, S. Analysis of membrane protein interactions using yeast-based technologies. Trends Biochem Sci. 27 (11), 559-563 (2002).
- Iyer, K. Utilizing the split-ubiquitin membrane yeast two-hybrid system to identify protein-protein interactions of integral membrane proteins. Sci STKE. 275, pl3-pl3 (2005).
- Paumi, C. M. Mapping protein-protein interactions for the yeast ABC transporter Ycf1p by integrated split-ubiquitin membrane yeast two-hybrid analysis. Mol Cell. 26 (1), 15-25 (2007).
- Stagljar, I. A genetic system based on split-ubiquitin for the analysis of interactions between membrane proteins in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (9), 5187-5192 (1998).
- Gisler, S. M. Monitoring protein-protein interactions between the mammalian integral membrane transporters and PDZ-interacting partners using a modified split-ubiquitin membrane yeast two-hybrid system. Mol Cell Proteomics. 7 (7), 1362-1377 (2008).
- Scheper, W. Coordination of N-glycosylation and protein translocation across the endoplasmic reticulum membrane by Sss1 protein. J Biol Chem. 278 (39), 37998-38003 (2003).
- Thaminy, S. Identification of novel ErbB3-interacting factors using the split-ubiquitin membrane yeast two-hybrid system. Genome Res. 13 (7), 1744-1753 (2003).
- Johnsson, N., Varshavsky, A. Split ubiquitin as a sensor of protein interactions in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (22), 10340-10344 (1994).
- Kelleher, D. J., Gilmore, R. The Saccharomyces cerevisiae oligosaccharyltransferase is a protein complex composed of Wbp1p, Swp1p, and four additional polypeptides. J Biol Chem. 269 (17), 12908-12917 (1994).
- Chevallier, M. R. Cloning and transcriptional control of a eucaryotic permease gene. Mol Cell Biol. 2 (8), 977-984 (1982).
