Split-Ubiquitin Basierend Membrane Yeast Two-Hybrid (Mythos) System: Ein wirksames Instrument zur Ermittlung von Protein-Protein-Wechselwirkungen
Summary
MYTHOS ermöglicht den empfindlichen Nachweis von transienten und stabilen Wechselwirkungen zwischen Proteinen, die im Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae exprimiert werden. Es wurde erfolgreich angewendet, um exogene und Hefe integrale Membranproteine zu studieren, um ihre Interaktionspartner in einem hohen Durchsatz Weise zu identifizieren.
Abstract
Die grundlegenden biologischen und klinischen Bedeutung von integralen Membranproteinen veranlasste die Entwicklung einer Hefe-basiertes System für die Hochdurchsatz-Identifizierung von Protein-Protein-Interaktionen (PPI) für full-length Transmembranproteine. Zu diesem Zweck entwickelt unser Labor das Split-Ubiquitin-basierten Membrane Yeast Two-Hybrid (Mythos) System. Diese Technologie ermöglicht den empfindlichen Nachweis von transienten und stabilen Protein-Wechselwirkungen mit<em> Saccharomyces cerevisiae</em> Als Wirtsorganismus. MYTHOS nutzt die Beobachtung, dass Ubiquitin in zwei stabile Einheiten getrennt werden können: Die C-terminale Hälfte von Hefe-Ubiquitin (C<sub> Ub</sub>) Und die N-terminale Hälfte des Ubiquitin-Einheit (N<sub> Ub</sub>). Im Mythos wird dieser Grundsatz für den Einsatz als "Sensor" von Protein-Protein-Wechselwirkungen angepasst. Kurz gesagt, ist die integrale Membranproteine Köderprotein zu C verschmolzen<sub> Ub</sub> Was ist es, eine künstliche Transkriptionsfaktor gebunden. Prey Proteine, entweder in einzelnen oder Bibliothek-Format werden die N verschmolzen<sub> Ub</sub> Einheit. Protein-Interaktion zwischen den Köder und Beute führt zum Auflösen des Ubiquitin-Einheiten bilden eine full-length "pseudo-Ubiquitin-Molekül. Dieses Molekül wiederum ist durch cytosolische deubiquitinating Enzyme erkannt, was zur Spaltung des Transkriptionsfaktors, und die anschließende Induktion der Expression des Reportergens. Das System ist sehr anpassungsfähig und eignet sich besonders für High-Throughput-Screening geeignet. Es wurde erfolgreich eingesetzt, um Interaktionen mit integralen Membranproteinen aus Hefe-und anderen Organismen zu untersuchen.
Protocol
Discussion
MYTHOS ist das erste System mit hohem Durchsatz, die die Identifizierung von Wechselwirkungen zwischen full-length Membranproteinen und cytosolische oder membrangebundene Partnern ermöglicht. Es wurde verwendet, um Membranprotein aus einer Reihe von Organismen [3-7] zu studieren. Es gibt jedoch bestimmte Details, die müssen unter die Lupe, um sicherzustellen, das Protein-of-interest zugänglich ist mit MYTHOS Studie werden können.
Viele membrangebundene Proteine sind an die Plasmame…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten Morgenröte Edmonds für eine kritische Lektüre des Manuskripts danken. Die Stagljar Labor wird aus Mitteln der kanadischen Stiftung für Innovation (CFI), die Canadian Institute for Health Research (CIHR), der Heart and Stroke Foundation, die Canadian Cancer Society und Novartis unterstützt.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Polyethenlene Glycol (PEG3350) | Bioshop | PEG335 | ||
| Lithium Acetate Bihydrate | Bioshop | LIA001 | ||
| X-Gal (5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-b-D-galactopyranoside) | Bioshop | XGA001 | ||
| N`,N-dimethyl formamide | Bioshop | DMF 451 | ||
| 3-amino-1,2,4-triazole (3-AT) | Bioshop | ATT124 | ||
| Sodium phosphate dibasic | Bioshop | SPD307 | ||
| Sodium phosphate monobasic | FisherBiotech | BP329-500 | ||
| Salmon Sperm DNA | VWR | CA80601-120 | ||
| D-Glucose | Bioshop | GLU501 | ||
| LB Broth LENOX | Bioshop | LBL405 | ||
| Yeast Nitrogen Base | Bioshop | YNB406 | ||
| Yeast Extract | Bioshop | YEX401 | ||
| Peptone | Beckton Dickinson | 211677 | ||
| Bio-Tryptone | Bioshop | TRP402 | ||
| Adenine Sulphate | Bioshop | ADS201 | ||
| L-Uracil | Bioshop | URA241 | ||
| L-Threonine | Bioshop | THR002 | ||
| L-Histidine | Bioshop | HIS200 | ||
| L-Methionine | Bioshop | MET222 | ||
| L-Valine | Bioshop | VAL201 | ||
| L-Phenylalanine | Bioshop | PHA302 | ||
| L-Isoleucine | Bioshop | ISO910 | ||
| L-Tyrosine | Bioshop | TYR333 | ||
| L-Leucine | Bioshop | LEU222 | ||
| L-Arginine | Bioshop | ARG006 | ||
| L-Tryptophane | FisherBiotech | BP395-100 | ||
| L-Lysine | Bioshop | LYS101 | ||
| L-Alanine | FisherBiotech | BP369-100 | ||
| Agar | Bioshop | AGR001 | ||
| Soda Lime Galss Beads | BioSpec Product | 11079105 | ||
| Sodium Chloride | Bioshop | SLD002 |
Referências
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