Split-Ubiquitina Yeast Membrana Baseado Two-Hybrid (MITO) do sistema: uma ferramenta poderosa para identificação de interações proteína-proteína
Summary
MITO permite a detecção de interações sensíveis transitória e estável entre as proteínas que são expressas no modelo de Saccharomyces cerevisiae organismo. Tem sido aplicado com sucesso para estudar exógenos e leveduras proteínas integrais da membrana, a fim de identificar seus parceiros interagem de uma forma de alto rendimento.
Abstract
A importância fundamental biológico e clínico de proteínas integrais da membrana solicitado o desenvolvimento de um sistema baseado em levedura para a identificação de alto rendimento de interações proteína-proteína (PPI) para as proteínas transmembrana full-length. Para este fim, nosso laboratório desenvolveu o split-ubiquitina Yeast membrana baseada Two-Hybrid (MITO) do sistema. Esta tecnologia permite a detecção sensível de interações proteína transiente e estável usando<em> Saccharomyces cerevisiae</em> Como um organismo hospedeiro. MITO aproveita a observação de que a ubiquitina pode ser separado em duas metades estável: a metade C-terminal da ubiquitina levedura (C<sub> Ub</sub>) E a metade N-terminal da molécula de ubiquitina (N<sub> Ub</sub>). No mito, este princípio é adaptado para uso como um "sensor" de interações proteína-proteína. Resumidamente, a proteína isca integrante membrana é fundido a C<sub> Ub</sub> O que é ligado a um fator de transcrição artificial. Proteínas presas, seja em formato individual ou biblioteca, são fundidos para o N<sub> Ub</sub> Fracção. Interação entre proteínas a isca e presa leva a reconstituição da ubiquitina metades, formando um full-length 'pseudo-ubiquitina "molécula. Esta molécula é, por sua vez reconhecido por enzimas citosólicas deubiquitinating, resultando na clivagem do fator de transcrição, e subsequente indução da expressão do gene repórter. O sistema é altamente adaptável, e é particularmente adequado para high-throughput screening. Ela tem sido empregada com sucesso para investigar as interações utilizando proteínas integrais da membrana da levedura e outros organismos.
Protocol
Discussion
MITO é o sistema de débito primeira alta que permite a identificação de interações entre proteínas de longa-metragem de membrana e citosólica ou ligada à membrana parceiros. Ela tem sido usada para estudar proteínas de membrana de uma série de organismos [3-7]. Há, no entanto, detalhes específicos que podem precisar de ser examinado para assegurar a proteína de interesse é passível de estudo com MITO.
Muitos ligada à membrana proteínas são direcionadas para a membrana plas…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer Edmonds Alvorada para uma leitura crítica deste manuscrito. O laboratório Stagljar é apoiado por fundos da Fundação Canadense para Inovação (CFI), o Instituto Canadense de Pesquisa em Saúde (CIHR), a Fundação do Coração e Derrame, da Sociedade Canadense do Câncer, e Novartis.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Polyethenlene Glycol (PEG3350) | Bioshop | PEG335 | ||
| Lithium Acetate Bihydrate | Bioshop | LIA001 | ||
| X-Gal (5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-b-D-galactopyranoside) | Bioshop | XGA001 | ||
| N`,N-dimethyl formamide | Bioshop | DMF 451 | ||
| 3-amino-1,2,4-triazole (3-AT) | Bioshop | ATT124 | ||
| Sodium phosphate dibasic | Bioshop | SPD307 | ||
| Sodium phosphate monobasic | FisherBiotech | BP329-500 | ||
| Salmon Sperm DNA | VWR | CA80601-120 | ||
| D-Glucose | Bioshop | GLU501 | ||
| LB Broth LENOX | Bioshop | LBL405 | ||
| Yeast Nitrogen Base | Bioshop | YNB406 | ||
| Yeast Extract | Bioshop | YEX401 | ||
| Peptone | Beckton Dickinson | 211677 | ||
| Bio-Tryptone | Bioshop | TRP402 | ||
| Adenine Sulphate | Bioshop | ADS201 | ||
| L-Uracil | Bioshop | URA241 | ||
| L-Threonine | Bioshop | THR002 | ||
| L-Histidine | Bioshop | HIS200 | ||
| L-Methionine | Bioshop | MET222 | ||
| L-Valine | Bioshop | VAL201 | ||
| L-Phenylalanine | Bioshop | PHA302 | ||
| L-Isoleucine | Bioshop | ISO910 | ||
| L-Tyrosine | Bioshop | TYR333 | ||
| L-Leucine | Bioshop | LEU222 | ||
| L-Arginine | Bioshop | ARG006 | ||
| L-Tryptophane | FisherBiotech | BP395-100 | ||
| L-Lysine | Bioshop | LYS101 | ||
| L-Alanine | FisherBiotech | BP369-100 | ||
| Agar | Bioshop | AGR001 | ||
| Soda Lime Galss Beads | BioSpec Product | 11079105 | ||
| Sodium Chloride | Bioshop | SLD002 |
Referências
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