Split-ubiquitina levadura membrana base de dos híbridos (MITO) del sistema: Una poderosa herramienta para identificar interacciones proteína-proteína
Summary
MITO permite la detección sensible de las interacciones transitoria y estable entre las proteínas que se expresan en el organismo modelo Saccharomyces cerevisiae. Se ha aplicado con éxito para estudiar las proteínas integrales de membrana exógenos y la levadura con el fin de identificar a sus socios que interactúan de un modo de alto rendimiento.
Abstract
La importancia biológica fundamental y clínica de las proteínas integrales de membrana impulsado el desarrollo de un sistema a base de levadura para la identificación de alto rendimiento de las interacciones proteína-proteína (PPI) para las proteínas transmembrana de larga duración. Con este fin, nuestro laboratorio desarrolló la levadura split-ubiquitina membrana base de dos híbridos (MITO) del sistema. Esta tecnología permite la detección sensible de las interacciones proteína transitoria y estable con<em> Saccharomyces cerevisiae</em> Como un organismo huésped. MITO se aprovecha de la observación de que la ubiquitina se pueden separar en dos mitades estable: la mitad C-terminal de la levadura ubiquitina (C<sub> Ub</sub>) Y la mitad N-terminal de la fracción de ubiquitina (N<sub> Ub</sub>). En el mito, este principio se ha adaptado para su uso como un "sensor" de las interacciones proteína-proteína. En pocas palabras, la proteína de membrana integral cebo se funde con C<sub> Ub</sub> Que está relacionado con un factor de transcripción artificiales. Presa proteínas, ya sea en formato individual o de la biblioteca, se fusionan a la N<sub> Ub</sub> Mitad. La interacción entre la proteína cebo y la presa conduce a la reconstitución de los restos de la ubiquitina, formando una larga duración 'pseudo-ubiquitina "molécula. Esta molécula es a su vez reconocida por las enzimas citosólicas deubiquitinating, dando como resultado la escisión del factor de transcripción, y la posterior inducción de la expresión del gen. El sistema es muy adaptable, y está particularmente bien adaptado a la selección de alto rendimiento. Se ha empleado con éxito para investigar las interacciones con las proteínas integrales de membrana a partir de levaduras y otros organismos.
Protocol
Discussion
Mito es el primer sistema de alto rendimiento que permite la identificación de las interacciones entre las proteínas de membrana de larga duración y citosólica o socios de la membrana. Se ha utilizado para estudiar la proteína de la membrana de una serie de organismos [3-7]. Hay, sin embargo, los detalles específicos que deben ser examinados para asegurar que la proteína de interés puede ser objeto de estudio con el mito.
Muchas proteínas de membrana se dirigen a la membrana plasmá…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría dar las gracias a Edmonds amanecer para una lectura crítica de este manuscrito. El laboratorio Stagljar es apoyado por fondos de la Fundación Canadiense para la Innovación (CFI), el Instituto Canadiense de Investigación en Salud (CIHR), la Fundación Heart and Stroke, de la Sociedad Canadiense del Cáncer y Novartis.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Polyethenlene Glycol (PEG3350) | Bioshop | PEG335 | ||
| Lithium Acetate Bihydrate | Bioshop | LIA001 | ||
| X-Gal (5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-b-D-galactopyranoside) | Bioshop | XGA001 | ||
| N`,N-dimethyl formamide | Bioshop | DMF 451 | ||
| 3-amino-1,2,4-triazole (3-AT) | Bioshop | ATT124 | ||
| Sodium phosphate dibasic | Bioshop | SPD307 | ||
| Sodium phosphate monobasic | FisherBiotech | BP329-500 | ||
| Salmon Sperm DNA | VWR | CA80601-120 | ||
| D-Glucose | Bioshop | GLU501 | ||
| LB Broth LENOX | Bioshop | LBL405 | ||
| Yeast Nitrogen Base | Bioshop | YNB406 | ||
| Yeast Extract | Bioshop | YEX401 | ||
| Peptone | Beckton Dickinson | 211677 | ||
| Bio-Tryptone | Bioshop | TRP402 | ||
| Adenine Sulphate | Bioshop | ADS201 | ||
| L-Uracil | Bioshop | URA241 | ||
| L-Threonine | Bioshop | THR002 | ||
| L-Histidine | Bioshop | HIS200 | ||
| L-Methionine | Bioshop | MET222 | ||
| L-Valine | Bioshop | VAL201 | ||
| L-Phenylalanine | Bioshop | PHA302 | ||
| L-Isoleucine | Bioshop | ISO910 | ||
| L-Tyrosine | Bioshop | TYR333 | ||
| L-Leucine | Bioshop | LEU222 | ||
| L-Arginine | Bioshop | ARG006 | ||
| L-Tryptophane | FisherBiotech | BP395-100 | ||
| L-Lysine | Bioshop | LYS101 | ||
| L-Alanine | FisherBiotech | BP369-100 | ||
| Agar | Bioshop | AGR001 | ||
| Soda Lime Galss Beads | BioSpec Product | 11079105 | ||
| Sodium Chloride | Bioshop | SLD002 |
Referências
- Stagljar, I., Fields, S. Analysis of membrane protein interactions using yeast-based technologies. Trends Biochem Sci. 27 (11), 559-563 (2002).
- Iyer, K. Utilizing the split-ubiquitin membrane yeast two-hybrid system to identify protein-protein interactions of integral membrane proteins. Sci STKE. 275, pl3-pl3 (2005).
- Paumi, C. M. Mapping protein-protein interactions for the yeast ABC transporter Ycf1p by integrated split-ubiquitin membrane yeast two-hybrid analysis. Mol Cell. 26 (1), 15-25 (2007).
- Stagljar, I. A genetic system based on split-ubiquitin for the analysis of interactions between membrane proteins in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (9), 5187-5192 (1998).
- Gisler, S. M. Monitoring protein-protein interactions between the mammalian integral membrane transporters and PDZ-interacting partners using a modified split-ubiquitin membrane yeast two-hybrid system. Mol Cell Proteomics. 7 (7), 1362-1377 (2008).
- Scheper, W. Coordination of N-glycosylation and protein translocation across the endoplasmic reticulum membrane by Sss1 protein. J Biol Chem. 278 (39), 37998-38003 (2003).
- Thaminy, S. Identification of novel ErbB3-interacting factors using the split-ubiquitin membrane yeast two-hybrid system. Genome Res. 13 (7), 1744-1753 (2003).
- Johnsson, N., Varshavsky, A. Split ubiquitin as a sensor of protein interactions in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (22), 10340-10344 (1994).
- Kelleher, D. J., Gilmore, R. The Saccharomyces cerevisiae oligosaccharyltransferase is a protein complex composed of Wbp1p, Swp1p, and four additional polypeptides. J Biol Chem. 269 (17), 12908-12917 (1994).
- Chevallier, M. R. Cloning and transcriptional control of a eucaryotic permease gene. Mol Cell Biol. 2 (8), 977-984 (1982).
