Myt tillåter känslig detektion av transienta och stabil interaktioner mellan proteiner som uttrycks i modellen organismen Saccharomyces cerevisiae. Det har med framgång använts för att studera exogena och jäst integrerade membranproteiner i syfte att identifiera sina samverkande partner i en hög genomströmning sätt.
Den grundläggande biologiska och kliniska betydelsen av integrerad membranproteiner drev fram utvecklingen av en jäst-baserat system för hög genomströmning för identifiering av protein-protein interaktioner (PPI) för fullängds transmembrane proteiner. För detta ändamål utvecklat vårt labb split-ubiquitin baserade Membrane Jäst Två Hybrid (MYT) system. Denna teknik möjliggör känslig detektion av övergående och stabil protein interaktioner med<em> Saccharomyces cerevisiae</em> Som en värdorganismen. Myt utnyttjar iakttagelsen att ubiquitin kan delas upp i två stabila beståndsdelarna: C-terminala av jäst ubiquitin (C<sub> Ub</sub>) Och N-terminal hälften av ubiquitin fraktionen (N<sub> Ub</sub>). I myten är denna princip anpassat för att användas som en "givare" av protein-protein interaktioner. Kortfattat är integrerad membran bete protein smält till C<sub> Ub</sub> Som är kopplad till en konstgjord transkriptionsfaktor. Prey proteiner, antingen enskilt eller biblioteket format, smält till N<sub> Ub</sub> Fraktionen. Protein samspelet mellan bete och bytesdjur leder till upplösning av det ubiquitin beståndsdelarna som bildar en fullängds "pseudo-ubiquitin" molekyl. Denna molekyl är i sin tur erkänns av cytosoliskt deubiquitinating enzymer, vilket resulterar i klyvning av transkriptionsfaktor, och efterföljande induktion av reporter genuttryck. Systemet är mycket anpassningsbar, och är särskilt väl lämpad för high-throughput screening. Det har framgångsrikt används för att undersöka interaktioner med integrerad membranproteiner från både jäst och andra organismer.
Myt är den första hög genomströmning system som möjliggör identifiering av interaktioner mellan full längd membranproteiner och cytosola eller membranbundna partner. Det har använts för att studera membranproteiner från en rad organismer [3-7]. Det finns dock vissa detaljer som kan behöva granskas för att säkerställa protein-av-intresse är mottaglig att studera med myt.
Många membranbundna proteiner är riktad till plasmamembranet via en signal sekvens som sedan klyvs att pro…
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka Dawn Edmonds för en kritisk läsning av detta manuskript. Den Stagljar labbet stöds av medel från den kanadensiska institutet för innovation (CFI), den kanadensiska Institute for Health Research (CIHR), hjärtat och Stroke Foundation, den kanadensiska Cancerfonden, och Novartis.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Polyethenlene Glycol (PEG3350) | Bioshop | PEG335 | ||
Lithium Acetate Bihydrate | Bioshop | LIA001 | ||
X-Gal (5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-b-D-galactopyranoside) | Bioshop | XGA001 | ||
N`,N-dimethyl formamide | Bioshop | DMF 451 | ||
3-amino-1,2,4-triazole (3-AT) | Bioshop | ATT124 | ||
Sodium phosphate dibasic | Bioshop | SPD307 | ||
Sodium phosphate monobasic | FisherBiotech | BP329-500 | ||
Salmon Sperm DNA | VWR | CA80601-120 | ||
D-Glucose | Bioshop | GLU501 | ||
LB Broth LENOX | Bioshop | LBL405 | ||
Yeast Nitrogen Base | Bioshop | YNB406 | ||
Yeast Extract | Bioshop | YEX401 | ||
Peptone | Beckton Dickinson | 211677 | ||
Bio-Tryptone | Bioshop | TRP402 | ||
Adenine Sulphate | Bioshop | ADS201 | ||
L-Uracil | Bioshop | URA241 | ||
L-Threonine | Bioshop | THR002 | ||
L-Histidine | Bioshop | HIS200 | ||
L-Methionine | Bioshop | MET222 | ||
L-Valine | Bioshop | VAL201 | ||
L-Phenylalanine | Bioshop | PHA302 | ||
L-Isoleucine | Bioshop | ISO910 | ||
L-Tyrosine | Bioshop | TYR333 | ||
L-Leucine | Bioshop | LEU222 | ||
L-Arginine | Bioshop | ARG006 | ||
L-Tryptophane | FisherBiotech | BP395-100 | ||
L-Lysine | Bioshop | LYS101 | ||
L-Alanine | FisherBiotech | BP369-100 | ||
Agar | Bioshop | AGR001 | ||
Soda Lime Galss Beads | BioSpec Product | 11079105 | ||
Sodium Chloride | Bioshop | SLD002 |