Split-ubiquitin Baserat Membrane Jäst Två Hybrid (MYT) System: ett kraftfullt verktyg för att identifiera Protein-protein interaktioner
Summary
Myt tillåter känslig detektion av transienta och stabil interaktioner mellan proteiner som uttrycks i modellen organismen Saccharomyces cerevisiae. Det har med framgång använts för att studera exogena och jäst integrerade membranproteiner i syfte att identifiera sina samverkande partner i en hög genomströmning sätt.
Abstract
Den grundläggande biologiska och kliniska betydelsen av integrerad membranproteiner drev fram utvecklingen av en jäst-baserat system för hög genomströmning för identifiering av protein-protein interaktioner (PPI) för fullängds transmembrane proteiner. För detta ändamål utvecklat vårt labb split-ubiquitin baserade Membrane Jäst Två Hybrid (MYT) system. Denna teknik möjliggör känslig detektion av övergående och stabil protein interaktioner med<em> Saccharomyces cerevisiae</em> Som en värdorganismen. Myt utnyttjar iakttagelsen att ubiquitin kan delas upp i två stabila beståndsdelarna: C-terminala av jäst ubiquitin (C<sub> Ub</sub>) Och N-terminal hälften av ubiquitin fraktionen (N<sub> Ub</sub>). I myten är denna princip anpassat för att användas som en "givare" av protein-protein interaktioner. Kortfattat är integrerad membran bete protein smält till C<sub> Ub</sub> Som är kopplad till en konstgjord transkriptionsfaktor. Prey proteiner, antingen enskilt eller biblioteket format, smält till N<sub> Ub</sub> Fraktionen. Protein samspelet mellan bete och bytesdjur leder till upplösning av det ubiquitin beståndsdelarna som bildar en fullängds "pseudo-ubiquitin" molekyl. Denna molekyl är i sin tur erkänns av cytosoliskt deubiquitinating enzymer, vilket resulterar i klyvning av transkriptionsfaktor, och efterföljande induktion av reporter genuttryck. Systemet är mycket anpassningsbar, och är särskilt väl lämpad för high-throughput screening. Det har framgångsrikt används för att undersöka interaktioner med integrerad membranproteiner från både jäst och andra organismer.
Protocol
Discussion
Myt är den första hög genomströmning system som möjliggör identifiering av interaktioner mellan full längd membranproteiner och cytosola eller membranbundna partner. Det har använts för att studera membranproteiner från en rad organismer [3-7]. Det finns dock vissa detaljer som kan behöva granskas för att säkerställa protein-av-intresse är mottaglig att studera med myt.
Många membranbundna proteiner är riktad till plasmamembranet via en signal sekvens som sedan klyvs att pro…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Dawn Edmonds för en kritisk läsning av detta manuskript. Den Stagljar labbet stöds av medel från den kanadensiska institutet för innovation (CFI), den kanadensiska Institute for Health Research (CIHR), hjärtat och Stroke Foundation, den kanadensiska Cancerfonden, och Novartis.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Polyethenlene Glycol (PEG3350) | Bioshop | PEG335 | ||
| Lithium Acetate Bihydrate | Bioshop | LIA001 | ||
| X-Gal (5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-b-D-galactopyranoside) | Bioshop | XGA001 | ||
| N`,N-dimethyl formamide | Bioshop | DMF 451 | ||
| 3-amino-1,2,4-triazole (3-AT) | Bioshop | ATT124 | ||
| Sodium phosphate dibasic | Bioshop | SPD307 | ||
| Sodium phosphate monobasic | FisherBiotech | BP329-500 | ||
| Salmon Sperm DNA | VWR | CA80601-120 | ||
| D-Glucose | Bioshop | GLU501 | ||
| LB Broth LENOX | Bioshop | LBL405 | ||
| Yeast Nitrogen Base | Bioshop | YNB406 | ||
| Yeast Extract | Bioshop | YEX401 | ||
| Peptone | Beckton Dickinson | 211677 | ||
| Bio-Tryptone | Bioshop | TRP402 | ||
| Adenine Sulphate | Bioshop | ADS201 | ||
| L-Uracil | Bioshop | URA241 | ||
| L-Threonine | Bioshop | THR002 | ||
| L-Histidine | Bioshop | HIS200 | ||
| L-Methionine | Bioshop | MET222 | ||
| L-Valine | Bioshop | VAL201 | ||
| L-Phenylalanine | Bioshop | PHA302 | ||
| L-Isoleucine | Bioshop | ISO910 | ||
| L-Tyrosine | Bioshop | TYR333 | ||
| L-Leucine | Bioshop | LEU222 | ||
| L-Arginine | Bioshop | ARG006 | ||
| L-Tryptophane | FisherBiotech | BP395-100 | ||
| L-Lysine | Bioshop | LYS101 | ||
| L-Alanine | FisherBiotech | BP369-100 | ||
| Agar | Bioshop | AGR001 | ||
| Soda Lime Galss Beads | BioSpec Product | 11079105 | ||
| Sodium Chloride | Bioshop | SLD002 |
Referências
- Stagljar, I., Fields, S. Analysis of membrane protein interactions using yeast-based technologies. Trends Biochem Sci. 27 (11), 559-563 (2002).
- Iyer, K. Utilizing the split-ubiquitin membrane yeast two-hybrid system to identify protein-protein interactions of integral membrane proteins. Sci STKE. 275, pl3-pl3 (2005).
- Paumi, C. M. Mapping protein-protein interactions for the yeast ABC transporter Ycf1p by integrated split-ubiquitin membrane yeast two-hybrid analysis. Mol Cell. 26 (1), 15-25 (2007).
- Stagljar, I. A genetic system based on split-ubiquitin for the analysis of interactions between membrane proteins in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (9), 5187-5192 (1998).
- Gisler, S. M. Monitoring protein-protein interactions between the mammalian integral membrane transporters and PDZ-interacting partners using a modified split-ubiquitin membrane yeast two-hybrid system. Mol Cell Proteomics. 7 (7), 1362-1377 (2008).
- Scheper, W. Coordination of N-glycosylation and protein translocation across the endoplasmic reticulum membrane by Sss1 protein. J Biol Chem. 278 (39), 37998-38003 (2003).
- Thaminy, S. Identification of novel ErbB3-interacting factors using the split-ubiquitin membrane yeast two-hybrid system. Genome Res. 13 (7), 1744-1753 (2003).
- Johnsson, N., Varshavsky, A. Split ubiquitin as a sensor of protein interactions in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (22), 10340-10344 (1994).
- Kelleher, D. J., Gilmore, R. The Saccharomyces cerevisiae oligosaccharyltransferase is a protein complex composed of Wbp1p, Swp1p, and four additional polypeptides. J Biol Chem. 269 (17), 12908-12917 (1994).
- Chevallier, M. R. Cloning and transcriptional control of a eucaryotic permease gene. Mol Cell Biol. 2 (8), 977-984 (1982).
