Split-Ubiquitin Dayalı Membran Maya İki Hybrid (MİT) Sistemi: protein-protein etkileşimleri belirlenmesi için güçlü bir araç
Summary
MİT, geçici ve istikrarlı model organizma Saccharomyces cerevisiae ifade proteinler arasındaki etkileşimleri hassas algılama sağlar. Bu, yüksek kapasiteli bir şekilde etkileşim ortakları belirlemek amacıyla eksojen ve maya integral membran proteinleri çalışma başarıyla tatbik edilmiştir.
Abstract
Integral membran proteinlerinin temel biyolojik ve klinik önemi tam uzunlukta transmembran proteinler için protein-protein etkileşimleri (ÜFE), yüksek verimli bir tanımlama için bir maya-tabanlı sistem geliştirme istenir. Bu amaçla, bizim laboratuvar split-ubikuitin Membran Maya İki Hybrid (MİT) sistemi geliştirdi. Bu teknoloji kullanarak geçici ve istikrarlı bir protein etkileşimleri hassas algılama sağlar<em> Saccharomyces cerevisiae</em> Konak organizma olarak. MİT ubikuitin iki istikrarlı moieties ayrılmış olabilir gözlem yararlanır: (maya C-terminal yarı ubikuitin C<sub> Ub</sub>) Ve N-terminal ubikuitin kısmın yarısı (N<sub> Ub</sub>). MİT, bu prensip protein-protein etkileşimleri 'sensör' olarak kullanılmak üzere uyarlanmıştır. Kısaca, integral membran yem protein C eritilir.<sub> Ub</sub> Yapay bir transkripsiyon faktörü bağlıdır. Prey proteinler, ya bireysel ya da kütüphane biçimi N kaynaşmıştır<sub> Ub</sub> Benzer parçaları. Yem ve av arasındaki Protein etkileşimi, tam uzunlukta 'pseudo-ubikuitin' molekülü oluşturan ubikuitin moieties sulandırıldıktan yol açar. Bu molekül, transkripsiyon faktörü ve raportör gen ekspresyonu sonraki indüksiyon bölünme sonucu, deubiquitinating sitozolik enzimler tarafından tanınan sırayla. Sistem son derece uyarlanabilir ve özellikle yüksek verimli tarama için çok uygundur. Bu maya ve diğer organizmalar hem de integral membran proteinleri kullanarak etkileşimleri araştırmak için başarılı bir işe alındı.
Protocol
Discussion
MİT, tam uzunlukta membran proteinleri ve sitozolik veya membrana bağlı ortaklar arasındaki etkileşimlerin belirlenmesi sağlayan ilk yüksek kapasiteli bir sistemdir. Membran proteini organizmalar [3-7] bir dizi çalışma için kullanılır olmuştur. Ancak, protein-faiz MİT ile çalışmak için uygun olduğundan emin olmak için incelenip gerekebilir belirli ayrıntıları vardır.
Birçok membrana bağlı proteinler daha sonra olgun bir protein üretmek için bölünmüş bir siny…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Şafak Edmonds Bu yazının eleştirel bir okuma için teşekkür etmek istiyorum. Stagljar laboratuvar Kanada Yenilik (CFI), Kanada Sağlık Araştırmaları (CIHR) Enstitüsü, Kalp ve İnme Vakfı, Kanada Kanser Derneği ve Novartis Vakfı fonları tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Polyethenlene Glycol (PEG3350) | Bioshop | PEG335 | ||
| Lithium Acetate Bihydrate | Bioshop | LIA001 | ||
| X-Gal (5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-b-D-galactopyranoside) | Bioshop | XGA001 | ||
| N`,N-dimethyl formamide | Bioshop | DMF 451 | ||
| 3-amino-1,2,4-triazole (3-AT) | Bioshop | ATT124 | ||
| Sodium phosphate dibasic | Bioshop | SPD307 | ||
| Sodium phosphate monobasic | FisherBiotech | BP329-500 | ||
| Salmon Sperm DNA | VWR | CA80601-120 | ||
| D-Glucose | Bioshop | GLU501 | ||
| LB Broth LENOX | Bioshop | LBL405 | ||
| Yeast Nitrogen Base | Bioshop | YNB406 | ||
| Yeast Extract | Bioshop | YEX401 | ||
| Peptone | Beckton Dickinson | 211677 | ||
| Bio-Tryptone | Bioshop | TRP402 | ||
| Adenine Sulphate | Bioshop | ADS201 | ||
| L-Uracil | Bioshop | URA241 | ||
| L-Threonine | Bioshop | THR002 | ||
| L-Histidine | Bioshop | HIS200 | ||
| L-Methionine | Bioshop | MET222 | ||
| L-Valine | Bioshop | VAL201 | ||
| L-Phenylalanine | Bioshop | PHA302 | ||
| L-Isoleucine | Bioshop | ISO910 | ||
| L-Tyrosine | Bioshop | TYR333 | ||
| L-Leucine | Bioshop | LEU222 | ||
| L-Arginine | Bioshop | ARG006 | ||
| L-Tryptophane | FisherBiotech | BP395-100 | ||
| L-Lysine | Bioshop | LYS101 | ||
| L-Alanine | FisherBiotech | BP369-100 | ||
| Agar | Bioshop | AGR001 | ||
| Soda Lime Galss Beads | BioSpec Product | 11079105 | ||
| Sodium Chloride | Bioshop | SLD002 |
Referências
- Stagljar, I., Fields, S. Analysis of membrane protein interactions using yeast-based technologies. Trends Biochem Sci. 27 (11), 559-563 (2002).
- Iyer, K. Utilizing the split-ubiquitin membrane yeast two-hybrid system to identify protein-protein interactions of integral membrane proteins. Sci STKE. 275, pl3-pl3 (2005).
- Paumi, C. M. Mapping protein-protein interactions for the yeast ABC transporter Ycf1p by integrated split-ubiquitin membrane yeast two-hybrid analysis. Mol Cell. 26 (1), 15-25 (2007).
- Stagljar, I. A genetic system based on split-ubiquitin for the analysis of interactions between membrane proteins in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (9), 5187-5192 (1998).
- Gisler, S. M. Monitoring protein-protein interactions between the mammalian integral membrane transporters and PDZ-interacting partners using a modified split-ubiquitin membrane yeast two-hybrid system. Mol Cell Proteomics. 7 (7), 1362-1377 (2008).
- Scheper, W. Coordination of N-glycosylation and protein translocation across the endoplasmic reticulum membrane by Sss1 protein. J Biol Chem. 278 (39), 37998-38003 (2003).
- Thaminy, S. Identification of novel ErbB3-interacting factors using the split-ubiquitin membrane yeast two-hybrid system. Genome Res. 13 (7), 1744-1753 (2003).
- Johnsson, N., Varshavsky, A. Split ubiquitin as a sensor of protein interactions in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (22), 10340-10344 (1994).
- Kelleher, D. J., Gilmore, R. The Saccharomyces cerevisiae oligosaccharyltransferase is a protein complex composed of Wbp1p, Swp1p, and four additional polypeptides. J Biol Chem. 269 (17), 12908-12917 (1994).
- Chevallier, M. R. Cloning and transcriptional control of a eucaryotic permease gene. Mol Cell Biol. 2 (8), 977-984 (1982).
