Ein Protokoll für die Produktion von KLRG1 Tetramer
Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Produktion von KLRG1 Tetramer, die ein leistungsfähiges Werkzeug für die Analyse von KLRG1 Liganden ist.
Abstract
Killer-Zelle Lektin-like-Rezeptor G1 (KLRG1) ist ein Typ II Transmembran-Glykoprotein inhibitorischen Rezeptor gehört zu den C-Typ Lektin-ähnliche Superfamilie. KLRG1 existiert sowohl als Monomer und als Disulfid-linked-Homodimer. Dieses gut erhaltene Rezeptor befindet sich auf der reifsten und zuletzt aktivierte NK-Zellen als auch auf eine Teilmenge von Effektor / Memory T-Zellen gefunden.
Mit KLRG1 Tetramer sowie andere Methoden, E-, N-und R-Cadherine wurden als KLRG1 Liganden identifiziert. Diese Ca 2 +-abhängige Zell-Zell-Adhäsionsmoleküle besteht aus einer extrazellulären Domäne mit fünf Cadherin wiederholt für Zell-Zell-Interaktionen, eine Transmembrandomäne und eine cytoplasmatische Domäne, die an das Aktin-Zytoskelett verknüpft ist.
Die Erzeugung der KLRG1 Tetramer war notwendig, um die Identifikation der KLRG1 Liganden. KLRG1 Tetramer ist auch ein einzigartiges Werkzeug, um die Rollen Cadherin und KLRG1 spielen bei der Regulation der Immunantwort und Gewebe Integrität aufzuklären.
Protocol
Discussion
In diesem Protokoll wird gezeigt, wie man zu reinigen, und Biotinylierung tetramerize KLRG1. KLRG1 Tetramer kann verwendet werden, um KLRG1 Liganden mittels Durchflusszytometrie Label sein. Obwohl Rückfaltungsbedingungen müssen empirisch für jedes Protein getestet werden, könnten auch andere C-Typ-Lektine tetramerisieren mit einem ähnlichen Protokoll. Mit tetramerisieren Proteine als Sonden, Liganden zu Orphan C-Typ Lektin-Rezeptoren möglicherweise identifiziert werden.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Naidenko um Hilfe bei der Optimierung der Rückfaltung Bedingungen. Diese Arbeit wurde vom NIH Forschungsstipendium AI58181 zu Laurent Brossay unterstützt. Cindy Banh wird durch NIH NRSA F31 AI080230 unterstützt.
Stephanie Terrizzi und Cindy Banh beitragen gleichermaßen zu dieser Arbeit.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| BirA Enzyme and Buffer | Biotinylation Kit | Avidity | BIRA500 | |
| Complete Mini Protease Inhibitor Tablets, EDTA Free | Reagent | Roche | 11 836 170 001 | or equivalent |
| Amicon Stirred Cell | Equipment | Millipore | Model #8400 | or equivalent |
| YM10 NMWL 10K ultrafiltration membrane | Filtration Supply | Millipore | 13642 | |
| 15 ml YM10 concentrator | Filtration Supply | Millipore | 4411 | |
| AKTAFPLC | Equipment | GE Healthcare | 18-1900-26 | |
| Sephacryl S-200 16/60 high-resolution column | Equipment | GE Healthcare | 17-1166-01 | |
| Strepavidin PE | Reagent | BD Biosciences | 554061 | or equivalent |
Referências
- Tessmer, M. S., Fugere, C., Stevenaert, F., Naidenko, O. V., Chong, H. J., Leclercq, G., Brossay, L. KLRG1 binds cadherins and preferentially associates with SHIP-1. Int Immunol. 19, 391-400 (2007).
- Grundemann, C., Bauer, M., Schweier, O., von Oppen, N., Lassing, U., Saudan, P., Becker, K. F., Karp, K., Hanke, T., Bachmann, M. F., Pircher, H. Cutting edge: identification of E-cadherin as a ligand for the murine killer cell lectin-like receptor G1. J Immunol. 176, 1311-1315 (2006).
- Ito, M., Maruyama, T., Saito, N., Koganei, S., Yamamoto, K., Matsumoto, N. Killer cell lectin-like receptor G1 binds three members of the classical cadherin family to inhibit NK cell cytotoxicity. J Exp Med. 203, 289-295 (2006).
- Li, Y., Hofmann, M., Wang, Q., Teng, L., Chlewicki, L. K., Pircher, H., Mariuzza, R. A. Structure of natural killer cell receptor KLRG1 bound to E-cadherin reveals basis for MHC-independent missing self recognition. Immunity. 31, 35-46 (2009).
- Nakamura, S., Kuroki, K., Ohki, I., Sasaki, K., Kajikawa, M., Maruyama, T., Ito, M., Kameda, Y., Ikura, M., Yamamoto, K., Matsumoto, N., Maenaka, K. K. Molecular basis for E-cadherin recognition by killer cell lectin-like receptor G1 (KLRG1). J Biol Chem. , .
