KLRG1 tetramer के उत्पादन के लिए एक प्रोटोकॉल
Summary
इस प्रोटोकॉल KLRG1 tetramer, जो KLRG1 ligands के विश्लेषण के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है के उत्पादन का वर्णन.
Abstract
खूनी सेल रिसेप्टर लेक्टिन की तरह G1 (KLRG1) एक प्रकार द्वितीय transmembrane ग्लाइकोप्रोटीन निरोधात्मक सी प्रकार लेक्टिन की तरह superfamily संबंधित रिसेप्टर है. KLRG1 दोनों एक monomer के रूप में और डाइसल्फ़ाइड से जुड़े homodimer के रूप में मौजूद है. यह अच्छी तरह से संरक्षित रिसेप्टर के रूप में के रूप में अच्छी तरह से effector / स्मृति टी कोशिकाओं के एक सबसेट पर सबसे परिपक्व और हाल ही में सक्रिय एन.के. कोशिकाओं पर पाया जाता है.
KLRG1 के रूप में के रूप में अच्छी तरह से tetramer अन्य तरीकों का उपयोग, ई, एन, और आर cadherins KLRG1 ligands के रूप में पहचान की गई. ये 2 Ca + निर्भर सेल कोशिका आसंजन अणुओं एक कोशिकी पाँच cadherin सेल सेल बातचीत, एक transmembrane डोमेन और एक cytoplasmic डोमेन है कि actin cytoskeleton से जुड़ा हुआ है के लिए जिम्मेदार दोहराता युक्त डोमेन शामिल हैं.
KLRG1 tetramer की पीढ़ी KLRG1 ligands की पहचान के लिए आवश्यक था. KLRG1 tetramer भी एक अद्वितीय प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और ऊतक की अखंडता को विनियमित करने में भूमिकाओं cadherin और KLRG1 खेलने को स्पष्ट उपकरण है.
Protocol
Discussion
इस प्रोटोकॉल में, यह दिखाया गया है कैसे शुद्ध करने के लिए, biotinylate, और tetramerize KLRG1. KLRG1 tetramer प्रवाह cytometry द्वारा KLRG1 ligands लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि refolding शर्तों empirically प्रत्येक प्रोटीन के लिए परीक्षण ?…
Acknowledgements
हम refolding शर्तों के अनुकूलन में मदद के लिए डॉ. Naidenko धन्यवाद. यह काम लौरेंत Brossay NIH अनुसंधान अनुदान AI58181 द्वारा समर्थित किया गया. सिंडी Banh एनआईएच एनआरएसए F31 AI080230 द्वारा समर्थित है.
स्टेफ़नी Terrizzi और सिंडी Banh इस काम के लिए समान रूप से योगदान करते हैं.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| BirA Enzyme and Buffer | Biotinylation Kit | Avidity | BIRA500 | |
| Complete Mini Protease Inhibitor Tablets, EDTA Free | Reagent | Roche | 11 836 170 001 | or equivalent |
| Amicon Stirred Cell | Equipment | Millipore | Model #8400 | or equivalent |
| YM10 NMWL 10K ultrafiltration membrane | Filtration Supply | Millipore | 13642 | |
| 15 ml YM10 concentrator | Filtration Supply | Millipore | 4411 | |
| AKTAFPLC | Equipment | GE Healthcare | 18-1900-26 | |
| Sephacryl S-200 16/60 high-resolution column | Equipment | GE Healthcare | 17-1166-01 | |
| Strepavidin PE | Reagent | BD Biosciences | 554061 | or equivalent |
Referências
- Tessmer, M. S., Fugere, C., Stevenaert, F., Naidenko, O. V., Chong, H. J., Leclercq, G., Brossay, L. KLRG1 binds cadherins and preferentially associates with SHIP-1. Int Immunol. 19, 391-400 (2007).
- Grundemann, C., Bauer, M., Schweier, O., von Oppen, N., Lassing, U., Saudan, P., Becker, K. F., Karp, K., Hanke, T., Bachmann, M. F., Pircher, H. Cutting edge: identification of E-cadherin as a ligand for the murine killer cell lectin-like receptor G1. J Immunol. 176, 1311-1315 (2006).
- Ito, M., Maruyama, T., Saito, N., Koganei, S., Yamamoto, K., Matsumoto, N. Killer cell lectin-like receptor G1 binds three members of the classical cadherin family to inhibit NK cell cytotoxicity. J Exp Med. 203, 289-295 (2006).
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- Nakamura, S., Kuroki, K., Ohki, I., Sasaki, K., Kajikawa, M., Maruyama, T., Ito, M., Kameda, Y., Ikura, M., Yamamoto, K., Matsumoto, N., Maenaka, K. K. Molecular basis for E-cadherin recognition by killer cell lectin-like receptor G1 (KLRG1). J Biol Chem. , .
