머릿속 RNA 현지화에서 Xenopus Oocytes

Summary

의 시각화<em> 생체내에</em> RNA 교통이 찬란 표시 RNA의 성적의 microinjection에 의해로 수행됩니다<em> Xenopus</em> oocytes, 공촛점 현미경으로 따라갔다.

Abstract

RNA의 지방화는 세포 극성을 설립의 보존 메커니즘입니다. Vg1 mRNA는 Xenopus laevis oocytes과 공간의 Vg1 단백질의 유전자 발현을 제한하는 행위의 식물 극을 localizes. 이러한 방식으로 Vg1 배포 꽉 제어는 개발 배아에서 적절한 세균 계층 사양이 필요합니다. mRNA의 3 'UTR에서 RNA의 시퀀스 요소는 Vg1 지역화 요소 (VLE)가 필요하며 직접 전송하기에 충분합니다. 생체내에 Vg1 mRNA의 인식 및 전송을 연구하기 위해, 우리는 단순한 시각적인 판독을 통해 트랜스 팩터 감독 전송 메커니즘의 광범위한 분석을 수있는 이미징 기술을 개발했습니다.

RNA의 지방화를 시각화하기 위해, 우리는 찬란 표시 VLE의 RNA를 합성하고 개별 oocytes에 대한 본 사항이 명시를 microinject. 주입된 RNA의 전송을 허용하는 oocyte 문화 후, oocytes 사전 공촛점 현미경으로 영상을 고정하고 탈수 있습니다. mRNA의 현지화 패턴의 시각화는 RNA 수송의 전체 경로를 모니터링 및 CIS – 행동 VLE (루이스 외., 2008에 바인딩 증명서 및 횡단 행동 요소 내의 요소에 대한 RNA 수송 감독의 역할을 식별에 대한 기록을 제공합니다 Messitt 외., 2008). 우리는 추가 RNAS과 단백질 (가뇽과 마우리, 2009 Messitt 외., 2008)와 함께 공동 지방화를 통해이 기술을 확장 있고, 모터 단백질의 파괴와 cytoskeleton와 함께 (Messitt 외., 2008) 탐침을 mRNA의 지방화를 기본 메커니즘.

Protocol

1 부 : 찬란 라벨 mRNA의 전사. RNA의 현지화 요소 또는 기타 관련 시퀀스를 포함하는 플라스미드 DNA를 Linearize 및 DEPC – H 2 O. 처리 1 μg / μl에 resuspend DNA 템플릿은 T7, SP6 또는 T3 RNA 효소에 의해 해독을위한 업스트림 발기인 사이트가 있어야합니다. 멸균 1.5mL 튜브에 다음 시약을 추가합니다 : A. 10X TX 버퍼 (M & M 참조) 2 μl B. 20X 모자 / NTP ?…

Discussion

여기 우리는 Xenopus의 oocytes에서 mRNA의 현지 시각을위한 프로토콜을 제시했습니다. 이 방법은, 찬란 표시 RNA의 성적표를 사용하면 이전에 dig​​oxigenin – 표시된 성적표와 함께 취득하고 간단하고 원위치 기반 접근법 (마우리과 멜튼, 1992, 고터오 외., 1997)보다 빠르고보다 노이즈 비율 높은 신호를했습니다. 이 방법을 사용하여, 우리는 엔지니어 순서 변이를 RNA 빠르게 생체내 기능에 ?…

Materials

10X Tx buffer

• 60 mM MgCl₂
• 400 mM Tris-HCl (pH 7.5)
• 20 mM spermidine-HCl

20x cap/NTP mix

• 10 mM CTP
• 10 mM ATP
• 9 mM UTP
• 2 mM GTP
• 20 mM G(ppp)G Cap Analog (New England Biolabs)

G-50 column

• Hydrate 5 g Sephadex G-50 beads (Sigma Aldrich) in 100 ml deionized H₂O. DEPC-treat for 30 min. and autoclave. Store incomplete stock at room temperature. Before use, add the following RNase-free solutions:
• 0.5 ml 0.2 M EDTA
• 1 ml 1 M Tris pH 8.0
• 0.5 ml 20% SDS
• Store complete G-50 solution at 4° C.
• Remove and discard the plunger from a 3 ml syringe (BD Biosciences) and place the barrel of the syringe into a 15 ml conical tube (Corning). Plug the syringe with a small amount of glass wool (a plug about half the size of a penny).
• Swirl complete G-50 solution to resuspend beads.
• Add 2 ml G-50 solution to the empty column.
• Spin for 1 minute at 1,000 x g in benchtop centrifuge.
• Add 200 μl DEPC-treated deionized H₂O to each column. Spin.
• Repeat wash twice more for a total of three washes.
• Remove syringe barrel to a fresh 15 ml conical tube.

Collagenase solution

• 75 mg collagenase from Clostridium histolyticum (Sigma Aldrich)
• 25 ml 0.1 M KPO₃+ (pH 7.4)

MBSH buffer

• 88 mM NaCl
• 1 mM KCl
• 2.4 mM NaHCO₃
• 0.82 mM MgSO₄ X 7H₂O
• 0.33 mM Ca(NO₃)₂ X 4H₂O
• 0.41 mM CaCl₂ X 6H₂O
• 10 mM HEPES (pH 7.6)

Oocyte Culture Medium

• 50% L15 medium
• 15 mM HEPES (pH 7.6)
• 1 mg/ml insulin
• 100 mg/ml gentamicin
• 50 U/ml nystatin
• 50 U/ml penicillin
• 50 mg/ml streptomycin

MEMFA solution

• 0.1 M MOPS (pH 7.4)
• 2 mM EGTA
• 1 mM MgSO₄
• 3.7% formaldehyde

Computing RNA yield

• Determine CPM in “input” and “incorporated” samples using a standard scintillation counter.
• incorporation = (“incorporated”) / (10 x “input”)
• Typical incorporation values range between ~0.03 and 0.10.
• Maximum theoretical yields for different polymerases:
  T7, T3, SP6 – 2.64 μg
• Reaction yield in μg = (maximum yield of polymerase used) X (incorporation)
• Dilute RNA to 50 nM = (μg RNA) / 320 / (length of RNA in bases) / (5X10^-8)
• The reaction usually yields ~50-100 μl of RNA at 50 nM.