ויזואליזציה של<em> In vivo</em> RNA תחבורה מושגת על ידי microinjection של תעתיקי רנ"א שכותרתו fluorescently לתוך<em> Xenopus</em> ביציות, ואחריו מיקרוסקופיה confocal.
לוקליזציה RNA הוא מנגנון שימור של הקמת הקוטביות בתא. Vg1 mRNA localizes לקוטב הצמחי של ביציות Xenopus laevis ופועלת במרחב להגביל ביטוי גנים של חלבון Vg1. פיקוח הדוק של הפצה Vg1 באופן זה נדרש מפרט שכבת נאות נבט בעובר המתפתח. אלמנטים RNA הרצף UTR 3 "של ה-mRNA, את אלמנט Vg1 לוקליזציה (VLE) נדרשים ומספיקים להעביר ישירות. כדי לחקור את ההכרה והובלה של mRNA Vg1 in vivo, פיתחנו טכניקה הדמיה המאפשרת ניתוח נרחב של טרנס גורם מנגנוני הובלה מכוונת דרך readout ויזואלית פשוטה.
כדי להמחיש לוקליזציה RNA, אנו לסנתז שכותרתו fluorescently RNA VLE ו microinject זו תעתיק לתוך ביציות בודדים. אחרי תרבות הביצית כדי לאפשר הובלה של RNA מוזרק, ביציות הן קבועות מיובש לפני הדמיה באמצעות מיקרוסקופיה confocal. ויזואליזציה של דפוסי לוקליזציה mRNA מספק readout לניטור מסלול שלם של רנ"א התחבורה לזיהוי תפקידים בהכוונת RNA תחבורה cis-משחק גורמים בתוך התמליל ואת טרנס משחק הגורמים לאגד את VLE (Lewis et al. 2008, Messitt et al. 2008). הרחבנו את הטכניקה הזו באמצעות לוקליזציה בשיתוף עם RNAs נוספים חלבונים (גניון ו Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), בשילוב עם הפרעה של חלבונים המנוע את cytoskeleton (Messitt et al. 2008) לחקור המנגנונים לוקליזציה mRNA.
כאן יש לנו הציגה פרוטוקול המאפשר הדמיה לוקליזציה mRNA ב ביציות Xenopus. שיטה זו, באמצעות שכותרתו fluorescently תעתיקי רנ"א יש אות גבוה יחס רעש ממה שהושג בעבר עם digoxigenin שכותרתו תמלילי והוא פשוט יותר מהר מאשר ב-situ גישות מבוסס (Mowry ו מלטון, 1992, Gautreau et al. 1997). באמצעות שיטה זו, אנו י?…
The authors have nothing to disclose.
העבודה שלנו על לוקליזציה RNA נתמכת על ידי מענק מ-NIH (R01GM071049) כדי KLM.
10X Tx buffer
20x cap/NTP mix
G-50 column
Collagenase solution
MBSH buffer
Oocyte Culture Medium
MEMFA solution
Computing RNA yield