Visualizando Localização RNA em Xenopus Oócitos

Summary

Visualização de<em> In vivo</em> RNA de transporte é realizado por microinjeção de transcrições fluorescente etiquetado RNA em<em> Xenopus</em> Oócitos, seguido por microscopia confocal.

Abstract

Localização de RNA é um mecanismo conservado do estabelecimento de polaridade celular. Vg1 mRNA localiza-se o pólo vegetal de oócitos Xenopus laevis e age para restringir espacialmente expressão gênica de Vg1 proteína. Um controlo apertado da Vg1 distribuição desta forma é necessário para especificação apropriada germe camada no embrião em desenvolvimento. Elementos de seqüência RNA na 3 'UTR do mRNA, o elemento de localização Vg1 (VLE) são necessários e suficientes para transporte directo. Para estudar o reconhecimento e transporte de Vg1 mRNA in vivo, temos desenvolvido uma técnica de imagem que permite a análise extensiva de trans-fator de mecanismos de transporte através de uma leitura dirigida visual simples.

Para visualizar a localização RNA, podemos sintetizar RNA fluorescente etiquetado VLE e microinject esta transcrição em oócitos individual. Após o cultivo de oócitos para permitir o transporte do RNA injetado, ovócitos são fixos e desidratado antes de imagens por microscopia confocal. Visualização dos padrões de localização mRNA fornece uma leitura para o monitoramento da via completa de RNA de transporte e para a identificação de papéis na direção de RNA de transporte para cis-acting elementos dentro da transcrição e trans-acting fatores que se ligam ao VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). Nós estendemos esta técnica através de co-localização com RNAs adicionais e proteínas (Gagnon e Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), e em combinação com a perturbação de proteínas motoras eo citoesqueleto (Messitt et al., 2008) para investigar mecanismos subjacentes localização mRNA.

Protocol

Parte 1: Transcrição de mRNA fluorescente etiquetado. Linearizar DNA plasmídeo contendo o elemento de localização RNA ou seqüência relevante e ressuspender em 1 mcg / mL com DEPC tratadas com H 2 O. O modelo de DNA deve ter sites de promotor a montante para a transcrição de T7, SP6, ou RNA polimerase T3. Adicionar os seguintes reagentes a um tubo de 1,5 ml estéril: a. 10X Tx buffer (ver M & M) 2 l b. 20X cap / NTP mix (ver …

Discussion

Aqui nós apresentamos um protocolo para a visualização de localização mRNA em oócitos Xenopus. Este método, usando transcrições fluorescente etiquetado RNA tem maior relação sinal-ruído do que o anteriormente obtido com marcada com digoxigenina transcrições e é mais simples e mais rápido do que in-situ abordagens baseadas (Mowry e Melton, 1992, Gautreau et al., 1997). Usando este método, podemos engenheiro RNA mutações sequência e rapidamente teste para função de vivo. Al…

Materials

10X Tx buffer

• 60 mM MgCl₂
• 400 mM Tris-HCl (pH 7.5)
• 20 mM spermidine-HCl

20x cap/NTP mix

• 10 mM CTP
• 10 mM ATP
• 9 mM UTP
• 2 mM GTP
• 20 mM G(ppp)G Cap Analog (New England Biolabs)

G-50 column

• Hydrate 5 g Sephadex G-50 beads (Sigma Aldrich) in 100 ml deionized H₂O. DEPC-treat for 30 min. and autoclave. Store incomplete stock at room temperature. Before use, add the following RNase-free solutions:
• 0.5 ml 0.2 M EDTA
• 1 ml 1 M Tris pH 8.0
• 0.5 ml 20% SDS
• Store complete G-50 solution at 4° C.
• Remove and discard the plunger from a 3 ml syringe (BD Biosciences) and place the barrel of the syringe into a 15 ml conical tube (Corning). Plug the syringe with a small amount of glass wool (a plug about half the size of a penny).
• Swirl complete G-50 solution to resuspend beads.
• Add 2 ml G-50 solution to the empty column.
• Spin for 1 minute at 1,000 x g in benchtop centrifuge.
• Add 200 μl DEPC-treated deionized H₂O to each column. Spin.
• Repeat wash twice more for a total of three washes.
• Remove syringe barrel to a fresh 15 ml conical tube.

Collagenase solution

• 75 mg collagenase from Clostridium histolyticum (Sigma Aldrich)
• 25 ml 0.1 M KPO₃+ (pH 7.4)

MBSH buffer

• 88 mM NaCl
• 1 mM KCl
• 2.4 mM NaHCO₃
• 0.82 mM MgSO₄ X 7H₂O
• 0.33 mM Ca(NO₃)₂ X 4H₂O
• 0.41 mM CaCl₂ X 6H₂O
• 10 mM HEPES (pH 7.6)

Oocyte Culture Medium

• 50% L15 medium
• 15 mM HEPES (pH 7.6)
• 1 mg/ml insulin
• 100 mg/ml gentamicin
• 50 U/ml nystatin
• 50 U/ml penicillin
• 50 mg/ml streptomycin

MEMFA solution

• 0.1 M MOPS (pH 7.4)
• 2 mM EGTA
• 1 mM MgSO₄
• 3.7% formaldehyde

Computing RNA yield

• Determine CPM in “input” and “incorporated” samples using a standard scintillation counter.
• incorporation = (“incorporated”) / (10 x “input”)
• Typical incorporation values range between ~0.03 and 0.10.
• Maximum theoretical yields for different polymerases:
  T7, T3, SP6 – 2.64 μg
• Reaction yield in μg = (maximum yield of polymerase used) X (incorporation)
• Dilute RNA to 50 nM = (μg RNA) / 320 / (length of RNA in bases) / (5X10^-8)
• The reaction usually yields ~50-100 μl of RNA at 50 nM.