Primárias células epiteliais brônquicas humanas Grown a partir de explantes
Summary
Aqui nós descrevemos um método detalhado para o cultivo primário células epiteliais brônquicas humanas a partir de explantes de tecido das vias aéreas brônquicas humanas incluindo o crescimento diferenciado em uma interface ar-líquido. Este método fornece uma fonte abundante de células primárias para investigar o papel do epitélio das vias aéreas pulmonares em saúde humana e doenças.
Abstract
Células epiteliais brônquicas humanas são necessários para os modelos de celular da doença e para investigar o efeito de excipientes e agentes farmacológicos sobre a função e estrutura de células epiteliais. Aqui nós descrevemos em detalhe o método de cultivo de células epiteliais brônquicas tecido das vias aéreas brônquicas que é colhida pelo cirurgião na hora da cirurgia de pulmão (câncer de pulmão por exemplo, ou cirurgia redutora de volume). Com a ética aprovação e consentimento informado, o cirurgião leva o que é necessário para a patologia e nos fornece uma porção brônquica que é remota a partir das áreas doentes. O tecido é então usado como fonte de explantes que podem ser usados para o cultivo de células epiteliais brônquicas primária em cultura. Segmentos brônquica cerca de 0,5 a 1 cm de comprimento e um centímetro de diâmetro ≤ são lavados com EBSS frio e do tecido parenquimatoso em excesso é removido. Segmentos são cortadas e picadas em 2-3mm<sup> 3</sup> Peças de tecido. As peças são usadas como fonte de células primárias. Depois de placas de revestimento 100 milímetros cultura por 1-2 hr com uma combinação de colágeno (30 mcg / ml), a fibronectina (10 mcg / ml) e BSA (10 mcg / ml), as placas estão riscados em áreas 4-5 e tecido peças são colocadas nas áreas riscado, então, meio de cultura (DMEM / Ham F-12 com aditivos) adequado para o crescimento das células epiteliais é adicionada e as placas são colocadas em uma incubadora a 37 ° C em 5% de CO<sub> 2</sub> Ar umidificado. O meio de cultura é trocado a cada 3-4 dias. As células epiteliais crescem as peças que formam cerca de 1,5 cm de diâmetro anéis em 3-4 semanas. Explantes pode ser reutilizado até 6 vezes movendo-as para novas placas pré-revestidas. Células são levantadas usando tripsina / EDTA, agrupados, contados e re-banhado em frascos T75 Bind celular para aumentar seus números. T75 frascos semeados com 2-3 milhões de células crescem a 80% em confluência de 4 semanas. Expandiu principal células epiteliais humanas podem ser cultivadas e permitiu diferenciar no ar-líquido interface. Métodos descritos aqui fornecer uma fonte abundante de células epiteliais brônquicas humanas a partir de tecidos recém-isoladas e permitir a estudar essas células como modelos de doença e de farmacologia e toxicologia de triagem.
Protocol
Discussion
Neste estudo nós apresentamos métodos detalhados para a cultura e expansão do ensino primário células epiteliais brônquicas humanas. Demonstramos como explantes e transplantes de tecido dos brônquios, cultivados nos meios de comunicação que promovem o crescimento de células epiteliais, pode fornecer uma fonte contínua de células epiteliais das vias aéreas humanas para estudos de modelos não-diferenciada de células (submersa) e diferenciados (cultivadas em ar-líquido interface) . Estas células podem ser …
Acknowledgements
Os autores são muito gratos ao Dr. Richard Inculet para fornecer os tecidos bronquiais. Aprovações Conselho de Ética em Pesquisa foram obtidos a partir Saúde de São José Hamilton e The University of Western Ontario / London Health Sciences Centre (Dr. David McCormack), Comitê de Tecidos e Arquivos, Departamento de Patologia. Agradecemos também a Ernie Spitzer (Electron Microscopy, McMaster University) para a prestação de TEMs das culturas de nosso ALI, e Farkas Daniela para fornecer alguns dos materiais necessários para a imunocoloração. Este trabalho foi financiado por uma doação de termo Bloco da Sociedade Torácica Ontário; Dr. Asma Yaghi foi apoiado por uma bolsa FSORC, Saúde São José, Hamilton, Ontário, Canadá.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Albumin from bovine serum, powder | Sigma | A4919 | Use for coating solution | |
| COLLAGEN TYPE I 0.1% Solution Sterile-filtered | Sigma | C8919 | Use for coating solution | |
| Fibronectin from human plasma | Sigma | F2006 | Use for coating solution | |
| Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS, sterile) | Sigma | 28888 | Use for rinsing tissue and for coating solution | |
| DMEM/Ham F-12 | Sigma | D8437 | ||
| FBS | Sigma | F1015 | Inactivate, then aliquot and freeze (-20°C); use fresh when needed | |
| Antibiotic-Antimycotic Stabilized | Sigma | A5955 | Aliquot into 2 ml vials and freeze (-20°C); use fresh when needed | |
| Albumin solution from bovine serum | Sigma | A8412 | BSA | |
| Pituitary Extract Bovine | Sigma | P1476 | BPE | |
| Epidermal growth factor | Sigma | E9644 | EGF | |
| (±)-Epinephrine | Sigma | E1635 | ||
| Insulin | Sigma | I6634 | ||
| Tranferrin Human | Sigma | T8158 | ||
| Triiodo-L-thyronine | Sigma | T6397 | ||
| Hydorcortisone | Sigma | H0888 | ||
| Retinoic Acid | Sigma | R2625 | ||
| Trypsin | Sigma | T9935 | ||
| EDTA | Sigma | E6758 | EDTA | |
| Phosphate buffered saline | Sigma | P5368 | PBS | |
| 70% ethanol | Use for disinfecting and cleaning | |||
| 24 well Transwells | Corning | 3470 | ||
| Cell Culture Flasks (T75) CLLBND from Corning | Fisher Scientific | 05-539-104 | These flasks have a Cell Bind coating which promotes cell attachment and growth | |
| Monoclonal Anti-Cytokeratin, pan-FITC antibody | Sigma | F3418 | Permeabilization: 0.2% TRITON X-100/PBS; Use 1:250 dilution | |
| Antibody: E-Cadherin (H108) | Santa Cruz | sc-7870 | Do not permeabilize; Use 1:250 dilution and A21207 (Invitrogen) as secondary antibody | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG | Invitrogen | A21207 | Use 1:400 dilution | |
| Antibody: Monoclonal mouse Anti- α-Smooth Muscle Actin-Cy3 | Sigma- Aldrich | C6198 | Permeabilization: 0.2% TRITON X-100/PBS; Use 1:100 dilution | |
| Antibody: Vimentin (RV202) | Santa Cruz | Sc-32322 | Permeabilization: 0.2% TRITON X-100/PBS; Use 1:100 dilution and T2402 (Sigma- Aldrich) as secondary antibody | |
| Rabbit anti-mouse TRITC | Sigma- Aldrich | T2402 | Use 1:400 dilution | |
| Antibody: CD31 or PECAM-1 (M-20) | Santa-Cruz | Sc-1506 | Do not permeabilize; Use 1:200 dilution and Donkey anti-goat IgG-FITC as secondary antibody | |
| Donkey anti-goat IgG-FITC | Santa-Cruz | Use 1:100 dilution | ||
| Vectashield Mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Refrigerate in the dark; stains nuclei and retains fluorescence during prolonged storage | |
| Vectashield Mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | Refrigerate in the dark; retains fluorescence during prolonged storage | |
| Hoechst Stain solution | Sigma | H6024 | Stains nuclei; use 1:10 dilution and Vectashield H-1000 |
Other requirements: incubator, biological safety cabinet (BSC), centrifuge, 100mm culture plates, sterile tubes (15 ml, 50 ml, and 2 ml), sterile pipette tips, scalpel handle and blades, small sharp scissors, lab coats and gloves. These can be obtained from your preferred suppliers.
Referências
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