血管新生の研究のために最適化されたフィブリンゲルビーズアッセイ
Summary
このビデオでは、血管新生の反復するいくつかの段階そのin vitroでの血管新生アッセイのプロトコルを示しています。タイムラプス発芽の画像、管腔形成、分岐と吻合 – 血管新生の主要な機能は – 示されています。
Abstract
血管新生は血管新生の刺激に応答して、新しい血管が既存の血管系から作成される、複雑なマルチステップのプロセスです。これらの手順は次のとおりです。基底膜の分解、細胞外マトリックスへの内皮細胞の増殖と移行（萌芽）（EC）、コードへのECのアラインメント、分岐、管腔形成、吻合、および新たな基底膜の形成を。 in vitroアッセイの多くは、このプロセスを研究するために開発が、ほとんど唯一の血管新生の特定の段階を模倣し、形態学的アッセイ内の血管が頻繁にin vivoで血管似ていないされています。 NehlsとDrenckhahnによる以前の仕事に基づいて、我々は、ヒト臍帯静脈ECと線維芽細胞を利用したin vitroでの血管新生アッセイに最適化されている。このモデルのすべての血管新生の主要な初期段階の反復するとは、重要なことは、血管が偏ECに囲まれた特許細胞間ルーメンを表示します。 ECはcytodexマイクロキャリア上に塗布し、フィブリンゲルに埋め込まれている。線維芽細胞は、それらがECはビーズの表面から発芽促進に必要な可溶性因子を提供するゲルの上に積層されている。数日後、数多くの血管が簡単に位相コントラストとタイムラプス顕微鏡で観察できる存在です。このビデオでは、これらの培養物をセットアップする重要なステップを示しています。
Protocol
Discussion
in vitroでの血管新生アッセイにおける3次元（3D）は2Dの文化を使って達成できるよりも生体内で実際の環境にかなり近いですモデルを提供する成長コンセンサスがある。それは、優れた3Dシステムは再現性、及び血管新生の主要なステップのいくつかを模倣することができるはず明らかである。いくつかの以前の3Dアッセイが開発されているが、これらの多くは、いずれかを使用して、ハードを取得するため?…
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Cytodex-3 Beads | Reagent | Amersham Pharmacia | 17-0485-01 | 10 g/bottle. 1. 0.5 g of dry beads are hydrated and swollen in 50 mL PBS (pH=7.4) for at least 3 hours at RT. Use a 50 mL tube and place it on the rocker. 2. Let the beads settle down (~ 15 min). Discard the supernatant and wash the beads for a few minutes in fresh PBS (50 mL). 3. Discard the PBS and replace with fresh PBS: 25 mL -> 20 mg/mL => 60000 beads/mL or 50 mL -> 10 mg/mL => 30000 beads/ mL 4. Place the bead suspension in a siliconized glass bottle (Windshield Wiper or Sigmacote). 5. Sterilize the beads by autoclaving for 15 min at 115C. 6. Store it at 4C. |
| Aprotinin | Reagent | Sigma | A-1153 | 10mg/bottle. Reconstitute lyophilized aprotinin at 4 U/mL in DI water. Sterile filter. Make aliquots of 1 mL each. Store at -20C. |
| Fibrinogen Type I | Reagent | Sigma | F-8630 | 1g. Dissolve 2 mg/mL fibrinogen in DPBS Note clottable protein % and adjust accordingly Heat in a 37C-water bath to dissolve the fibrinogen. Mix by inverting the tube. Do not vortex. Sterile filter through 0.22 um |
| Thrombin | Reagent | Sigma | T-3399 | 22 mg=1000 units. Reconstitute in sterile water at 50 U/mL. Make aliquots of 0.5 mL each. Store at -20C. |
Referências
- Nehls, V., Drenckhahn, D. A microcarrier-based cocultivation system for the investigation of factors and cells involved in angiogenesis in three-dimensional fibrin matrices in vitro. Histochem Cell Biol. 104, 459-466 (1995).
- Nehls, V., Drenckhahn, D. A novel, microcarrier-based in vitro assay for rapid and reliable quantification of three-dimensional cell migration and angiogenesis. Microvasc Res. 50, 311-322 (1995).
