Ottimizzato fibrina Gel Bead Assay per lo studio della angiogenesi

Summary

Questo video dimostra il protocollo di un test in vitro angiogenesi che ricapitola diverse fasi di angiogenesi. Time-lapse immagini di germinazione, formazione lumen, ramificazione e anastomosi – caratteristiche fondamentali di angiogenesi – sono mostrati.

Abstract

L'angiogenesi è un complesso processo multi-step, dove, in risposta a stimoli angiogenici, vengono creati nuovi vasi da vasi esistenti. Questi passaggi sono: la degradazione della membrana basale, la proliferazione e la migrazione (germogliamento) delle cellule endoteliali (CE) nella matrice extracellulare, l'allineamento della CE in corde, rami, la formazione di lume, anastomosi, e la formazione di una nuova membrana basale. Molti test in vitro sono stati sviluppati per studiare questo processo, ma la maggior parte solo mimare alcune fasi dell'angiogenesi, e morfologicamente i vasi all'interno del test spesso non assomigliano vasi in vivo. Sulla base di un precedente lavoro di Nehls e Drenckhahn, abbiamo ottimizzato un test in vitro che utilizza angiogenesi umano vena ombelicale CE e fibroblasti. Questo modello racchiude in sintesi tutte le fasi fondamentali all'inizio di angiogenesi e, soprattutto, i vasi di visualizzazione brevetto lumen intercellulare circondato da polarizzata CE. CE sono rivestiti su microcarriers cytodex e incorporato in un gel di fibrina. I fibroblasti sono stratificate sulla parte superiore del gel in cui prevedono necessario fattori solubili che favoriscono CE spuntano dalla superficie delle perline. Dopo alcuni giorni, sono presenti numerosi vasi che possono essere facilmente osservati in contrasto di fase e microscopia time-lapse. Questo video illustra i passaggi chiave nella creazione di queste culture.

Protocol

CELLE DI PREPARAZIONE Portare HUVEC e fibroblasti in M199/10% FBS / Pen-Strep (1:100) 1-2 giorni prima della bordatura. Passa medio EGM-2 (Clonetics) il giorno prima per bordare HUVEC e il giorno prima di embedding per fibroblasti. Una concentrazione di ~ 400 HUVEC al tallone è necessario. 20.000 fibroblasti per pozzetto è necessario. RIVESTIMENTO CON LE PERLE HUVEC – GIORNO -1 Trypsinize HUVEC. Lasciare perle di stabilirsi …

Discussion

C'è un consenso crescente che tridimensionali (3D) saggi in vitro angiogenesi offrire un modello che è molto più vicino all'ambiente reale in vivo che può essere raggiunto utilizzando culture 2D. È evidente che sistemi 3D superiore dovrebbe essere riproducibile, ed essere in grado di mimare alcuni dei passaggi principali di angiogenesi. Mentre diversi saggi precedenti 3D sono stati sviluppati, molti di questi utilizzare difficili da ottenere cellule microvascolari, o solo ricapitolare alcune delle tappe. In questo video, si des…

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Cytodex-3 Beads	Reagent	Amersham Pharmacia	17-0485-01	10 g/bottle. 1. 0.5 g of dry beads are hydrated and swollen in 50 mL PBS (pH=7.4) for at least 3 hours at RT. Use a 50 mL tube and place it on the rocker. 2. Let the beads settle down (~ 15 min). Discard the supernatant and wash the beads for a few minutes in fresh PBS (50 mL). 3. Discard the PBS and replace with fresh PBS: 25 mL -> 20 mg/mL => 60000 beads/mL or 50 mL -> 10 mg/mL => 30000 beads/ mL 4. Place the bead suspension in a siliconized glass bottle (Windshield Wiper or Sigmacote). 5. Sterilize the beads by autoclaving for 15 min at 115C. 6. Store it at 4C.
Aprotinin	Reagent	Sigma	A-1153	10mg/bottle. Reconstitute lyophilized aprotinin at 4 U/mL in DI water. Sterile filter. Make aliquots of 1 mL each. Store at -20C.
Fibrinogen Type I	Reagent	Sigma	F-8630	1g. Dissolve 2 mg/mL fibrinogen in DPBS Note clottable protein % and adjust accordingly Heat in a 37C-water bath to dissolve the fibrinogen. Mix by inverting the tube. Do not vortex. Sterile filter through 0.22 um
Thrombin	Reagent	Sigma	T-3399	22 mg=1000 units. Reconstitute in sterile water at 50 U/mL. Make aliquots of 0.5 mL each. Store at -20C.