Fertilizzazione Ovociti di Xenopus Utilizzando il metodo di trasferimento Host

Summary

Procedura per la concimazione<em> Ovociti di Xenopus</em> Con il metodo del trasferimento di accoglienza.

Abstract

Studiare il contributo di molecole ereditato dalla madre di vertebrati sviluppo precoce è spesso ostacolata dal tempo e la spesa necessaria per generare animali materno-effetto mutante. Inoltre, molte delle tecniche di iperespressione o inibire la funzione dei geni negli organismi come Xenopus zebrafish e non riescono a bersaglio sufficientemente critico le vie di segnalazione della madre, come il segnale Wnt. In Xenopus, manipolando la funzione dei geni negli ovociti in coltura e la loro successiva concimazione può migliorare questi problemi in una certa misura. Ovociti vengono manualmente defolliculated dal tessuto del donatore ovaio, iniettati o trattati in cultura come desiderato, quindi stimolati con progesterone per indurre la maturazione. Successivamente, gli ovociti vengono introdotti nella cavità del corpo di una rana ospitare l'ovulazione femminile, dopo di che verrà traslocato attraverso ovidotto del padrone di casa ed acquisire le modifiche e cappotti gelatina necessaria per la fecondazione. Gli embrioni risultanti possono essere elevato alla scena desiderata e analizzati gli effetti di eventuali perturbazioni sperimentale. L'host di trasferimento metodo è stato molto efficace nello scoprire i meccanismi fondamentali dello sviluppo precoce e consente una vasta gamma di possibilità di sperimentazione non disponibile in qualsiasi altro organismo modello vertebrato.

Protocol

1. La rimozione chirurgica del tessuto dell'ovaio Preparare un lotto fresco di media cultura ovocita (OCM; Materiali), tra 400-800 ml a seconda delle dimensioni dell'esperimento. Regolare il pH a 7,6-7,8, fino a quando il rosso fenolo trasforma un colore rosso scuro (sei o giù di piccole gocce di NaOH 5N). Versare una piccola quantità di controllare il pH in un tubo a parte in quanto l'elettrodo pH può contaminare i media. OCM deve essere conservato a 18 ° C e utilizzata entro u…

Discussion

Un trasferimento di successo si tradurrà in fertilizzazione e scissione normale> 50% degli ovociti (Figura 3). Generalmente tra 30-60% degli ovociti trasferiti sopravviverà passato le fasi neurula. Di solito il trasferimento 75-150 ovociti per ogni gruppo sperimentale, che sarà resa embrioni sufficiente per diversi tipi di analisi (in situ, RT-PCR), così come visualizzare il fenotipo. L'impianto di ovociti sostanzialmente più non sembra aumentare notevolmente la resa. Inoltre, almeno 30 ovociti per ogni grup…

Materials

Solutions and recipes:

OCM (Oocyte culture medium; modified from Wylie et al., 1996)

70% Leibovitz’s L-15 medium (containing l-glutamine)	(Invitrogen 11415-064)
0.4 mg/ml Bovine serum albumin (BSA; fraction V)	(Sigma A-9418-50g)
1x Penicillin-Streptomycin	(Sigma P-0781)
Adjust to pH 7.6-7.8 with 5N NaOH
Make fresh weekly, store at 18°C.

10X MMR (Marc’s Modified Ringer’s Solution; Zuck et al., 1998)

1M NaCl

20 mM KCl

20 mM CaCl2

10 mM MgCl2

150 mM HEPES

adjust to pH 7.6-7.8

Store at 4°C

Anesthetic solution

1 g/L 3-Aminobenzoic Acid Ethyl Ester (MS222)	(Sigma A-5040)
0.7 g/L sodium bicarbonate
Dissolve in Amquel-treated water
Make fresh weekly

Progesterone stocks

10 mM Progesterone (Sigma P- 0130) in 100% Ethanol

Dilute to 1 mM in 100% EtOH for a 500x stock/working solution

Store at -20°C

Vital dyes (modified from Heasman et al., 1991)

Blue: 0.1% Nile Blue A	(Aldrich 121479-5G),
Red: 0.25% Neutral Red	(Sigma N-6634),
Brown: 1% Bismarck Brown	(Sigma B-2759),
Green (80 μl blue + 80 μl brown),
Mauve (80 μl blue + 80 μl red).
A sixth color, Orange (80 μl red+ 80 μl brown), can also be used but is often hard to distinguish from brown.

Stocks of Blue, Red and Brown are made up in deionized water in 50 ml tubes, incubated for 20 minutes with rocking and spun in a clinical centrifuge. The supernatants are aliquotted into microfuge tubes and stored at -20°C.