Bemesting van Xenopus oöcyten Het gebruik van de Host Transfer Methode

Summary

Procedure voor bemesting<em> Xenopus oöcyten</em> Door de host overdrachtmethode.

Abstract

Het bestuderen van de bijdrage van de moeder geërfd moleculen tot de vroege ontwikkeling gewervelde wordt vaak gehinderd door de tijd en kosten die nodig zijn om de moeder-effect mutant dieren te genereren. Bovendien, veel van de technieken om overexpressie of genfunctie remmen in organismen zoals Xenopus en zebravis niet voldoende kritische doelgroep van moeders signaalwegen, zoals de Wnt-signalering. In Xenopus, kan manipuleren genfunctie in gekweekte eicellen bevruchten en vervolgens te verbeteren deze problemen tot op zekere hoogte. Eicellen worden handmatig defolliculated van donor eierstok weefsel, geïnjecteerd of worden behandeld in de cultuur als gewenst, en vervolgens gestimuleerd met progesteron tot rijping te induceren. Vervolgens worden de eicellen ingebracht in de lichaamsholte van een eisprong gastheer vrouwelijke kikker, waarna ze zullen worden getransloceerd via eileider van de gastheer en het verwerven van modificaties en gelei lagen nodig zijn voor de bevruchting. De resulterende embryo's kunnen vervolgens worden verhoogd tot het gewenste stadium en geanalyseerd op de gevolgen van een eventuele experimentele verstoringen. Deze host-transfer methode is zeer effectief in het blootleggen van fundamentele mechanismen van de vroege ontwikkeling en maakt een breed scala aan experimentele mogelijkheden niet beschikbaar in alle andere gewervelde modelorganisme.

Protocol

1. Chirurgische verwijdering van de eierstokken Tissue Maak een nieuwe partij van eicel kweekmedium (OCM, Materials), tussen 400 tot 800 ml, afhankelijk van de grootte van het experiment. Stel de pH op 7,6-7,8, totdat de fenol rood wordt een donkere rode kleur (zes of zo kleine druppeltjes van 5 N NaOH). Giet een klein bedrag om de pH te controleren in een aparte buis, omdat de pH-elektrode schadelijk zijn voor de media. OCM moet worden bewaard bij 18 ° C en binnen een week. Selectee…

Discussion

Een succesvolle overdracht zal leiden tot een bevruchting en normale splitsing van> 50% van de eicellen (figuur 3). Over het algemeen tussen de 30-60% van de overgedragen eicellen zal overleven langs de neurula fasen. We dragen doorgaans 75 tot 150 eicellen per experimentele groep, die voldoende embryo's zal opleveren voor verschillende soorten analyses (in situ, RT-PCR) en het visualiseren van het fenotype. Implanteren van aanzienlijk meer eicellen lijkt niet sterk te verhogen de opbrengst. Ook moet minstens 30 …

Materials

Solutions and recipes:

OCM (Oocyte culture medium; modified from Wylie et al., 1996)

70% Leibovitz’s L-15 medium (containing l-glutamine)	(Invitrogen 11415-064)
0.4 mg/ml Bovine serum albumin (BSA; fraction V)	(Sigma A-9418-50g)
1x Penicillin-Streptomycin	(Sigma P-0781)
Adjust to pH 7.6-7.8 with 5N NaOH
Make fresh weekly, store at 18°C.

10X MMR (Marc’s Modified Ringer’s Solution; Zuck et al., 1998)

1M NaCl

20 mM KCl

20 mM CaCl2

10 mM MgCl2

150 mM HEPES

adjust to pH 7.6-7.8

Store at 4°C

Anesthetic solution

1 g/L 3-Aminobenzoic Acid Ethyl Ester (MS222)	(Sigma A-5040)
0.7 g/L sodium bicarbonate
Dissolve in Amquel-treated water
Make fresh weekly

Progesterone stocks

10 mM Progesterone (Sigma P- 0130) in 100% Ethanol

Dilute to 1 mM in 100% EtOH for a 500x stock/working solution

Store at -20°C

Vital dyes (modified from Heasman et al., 1991)

Blue: 0.1% Nile Blue A	(Aldrich 121479-5G),
Red: 0.25% Neutral Red	(Sigma N-6634),
Brown: 1% Bismarck Brown	(Sigma B-2759),
Green (80 μl blue + 80 μl brown),
Mauve (80 μl blue + 80 μl red).
A sixth color, Orange (80 μl red+ 80 μl brown), can also be used but is often hard to distinguish from brown.

Stocks of Blue, Red and Brown are made up in deionized water in 50 ml tubes, incubated for 20 minutes with rocking and spun in a clinical centrifuge. The supernatants are aliquotted into microfuge tubes and stored at -20°C.