Gübrelenmesi Xenopus oositleri Host Transfer Yöntemi kullanılarak
Summary
Gübreleme için Prosedürü<em> Xenopus oositleri</em> Ana aktarma yöntemi.
Abstract
Erken gelişim omurgalı maternal miras moleküllerin katkısının incelenmesi genellikle etkisi anne-mutant hayvanlar üretmek için gerekli zaman ve masraf tarafından engellenmektedir. Ayrıca, pek çok teknik Xenopus ve zebrafish gibi organizmaların gen fonksiyonu eksprese veya etkisizleştirmek için yeterince Wnt sinyal gibi kritik anne sinyalizasyon yolaklar hedef başarısız. Xenopus, kültürlü oosit gen işlevi manipüle ve daha sonra onları gübreleme, bu sorunların bir ölçüde iyileştirebilir . Oosit donör yumurtalık dokusu elle defolliculated istediğiniz gibi enjekte veya kültür tedavi ve sonra olgunlaşma ikna etmek için progesteron ile uyarılır. Sonra, ev sahibi fallop borusunda transloke ve modifikasyon ve gübreleme için gerekli jöle kat kazanmak olacak bunun üzerine oosit yumurtladığımı ev sahibi kadın kurbağa vücut boşluğuna tanıtıldı. Oluşan embriyolar daha sonra istenilen aşamaya kaldırdı ve hiçbir deneysel tedirginlikler etkileri için analiz edilebilir. Bu konak-devret yöntemi erken gelişiminin temel mekanizmaları ortaya çıkarılması son derece etkili ve herhangi bir diğer omurgalı model organizmada mevcut değil deneysel olanakları geniş bir yelpazede sağlar.
Protocol
Discussion
Başarılı bir transfer, gübreleme ve oosit>% 50 (Şekil 3) normal bölünme neden olacaktır. Genellikle% 30-60 arasında transfer edilen oosit neurula aşamaları geçmiş hayatta kalacaktır. Biz genellikle 75-150 çeşitli analiz için yeterli embriyolar verecektir deney grubu başına oosit, (in situ, RT-PCR) gibi fenotip görselleştirme aktarın. Önemli ölçüde daha fazla oosit implantasyon büyük ölçüde verim artışı görünmüyor. Ayrıca, grup başına en az 30 oosit en azından bazı gastrulasyo…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar yazının eleştirel okuma Houston laboratuar sayesinde üyeleri istiyorum. Araştırma DWH verilen Ulusal Sağlık Enstitüleri (GM083999) tarafından desteklenen
Materials
Solutions and recipes:
OCM (Oocyte culture medium; modified from Wylie et al., 1996)
| 70% Leibovitz’s L-15 medium (containing l-glutamine) | (Invitrogen 11415-064) |
| 0.4 mg/ml Bovine serum albumin (BSA; fraction V) | (Sigma A-9418-50g) |
| 1x Penicillin-Streptomycin | (Sigma P-0781) |
| Adjust to pH 7.6-7.8 with 5N NaOH | |
| Make fresh weekly, store at 18°C. | |
10X MMR (Marc’s Modified Ringer’s Solution; Zuck et al., 1998)
| 1M NaCl |
| 20 mM KCl |
| 20 mM CaCl2 |
| 10 mM MgCl2 |
| 150 mM HEPES |
| adjust to pH 7.6-7.8 |
| Store at 4°C |
Anesthetic solution
| 1 g/L 3-Aminobenzoic Acid Ethyl Ester (MS222) | (Sigma A-5040) |
| 0.7 g/L sodium bicarbonate | |
| Dissolve in Amquel-treated water | |
| Make fresh weekly | |
Progesterone stocks
| 10 mM Progesterone (Sigma P- 0130) in 100% Ethanol |
| Dilute to 1 mM in 100% EtOH for a 500x stock/working solution |
| Store at -20°C |
Vital dyes (modified from Heasman et al., 1991)
| Blue: 0.1% Nile Blue A | (Aldrich 121479-5G), |
| Red: 0.25% Neutral Red | (Sigma N-6634), |
| Brown: 1% Bismarck Brown | (Sigma B-2759), |
| Green (80 μl blue + 80 μl brown), | |
| Mauve (80 μl blue + 80 μl red). | |
| A sixth color, Orange (80 μl red+ 80 μl brown), can also be used but is often hard to distinguish from brown. | |
Stocks of Blue, Red and Brown are made up in deionized water in 50 ml tubes, incubated for 20 minutes with rocking and spun in a clinical centrifuge. The supernatants are aliquotted into microfuge tubes and stored at -20°C.
Referências
- Brun, R. Oocyte maturation in vitro: contribution of the oviduct to total maturation in Xenopus laevis. Experientia. 31, 1275-1276 (1975).
- Elinson, R. P., Pasceri, P. Two UV-sensitive targets in dorsoanterior specification of frog embryos. Development. 106, 511-518 (1989).
- Heasman, J., Holwill, S., Wylie, C. C., C, C. Fertilization of cultured Xenopus oocytes and use in studies of maternally inherited molecules. Methods Cell Biol. 36, 213-230 (1991).
- Holwill, S., Heasman, J., Crawley, C., Wylie, C. C. Axis and germ line deficiencies caused by u.v irradiation of Xenopus oocytes cultured in vitro. Development. 100, 735-743 (1987).
- Houston, D. W., King, M. L. A critical role for Xdazl, a germ plasm-localized RNA, in the differentiation of primordial germ cells in Xenopus. Development. 127, 447-456 (2000).
- Mir, A., Heasman, J. How the mother can help: studying maternal Wnt signaling by anti-sense-mediated depletion of maternal mRNAs and the host transfer technique. Methods Mol Biol. 469, 417-429 (2008).
- Rugh, R. . Experimental Embryology: Techniques and procedures. , (1962).
- Smith, L. D., Ecker, R. E., Subtelny, S. In vitro induction of physiological maturation in Rana pipiens oocytes removed from their ovarian follicles. Dev Biol. 17, 627-643 (1968).
- Smith, L. D., Xu, W., Varnold, R. L. Oogenesis and oocyte isolation. Methods Cell Biol. 36, 45-60 (1991).
- Woolf, T. M., Jennings, C. G., Rebagliati, M., Melton, D. A. The stability, toxicity and effectiveness of unmodified and phosphorothioate antisense oligodeoxynucleotides in Xenopus oocytes and embryos. Nucleic Acids Res. 18, 1763-1769 (1990).
- Wylie, C., Kofron, M., Payne, C., Anderson, R., Hosobuchi, M., Joseph, E., Heasman, J. Maternal beta-catenin establishes a ‘dorsal signal’ in early Xenopus embryos. Development. 122, 2987-2996 (1996).
- Zhang, J., Houston, D. W., King, M. L., Payne, C., Wylie, C., Heasman, J. The role of maternal VegT in establishing the primary germ layers in Xenopus embryos. Cell. 94, 515-524 (1998).
- Zuck, M. V., Wylie, C. C., Heasman, J., Richter, J. D. Maternal mRNAs in Xenopus embryos: an antisense approach.. A comparative methods approach to the study of oocytes and embryos. , 341-354 (1998).
