التحقيق في الأنسجة والجهاز محددة الردود فيتوكروم باستخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية بمساعدة خلية من نوع التنميط معينة في التعبير thaliana Arabidopsis</em
Summary
ويجري التحقيق في الأساس الجزيئي للمكانية محددة ردود فيتوكروم استخدام النباتات المعدلة وراثيا التي تظهر الأنسجة والأعضاء القصور فيتوكروم محددة. عزل خلايا معينة العارضة التي يسببها استنزاف حامل اللون فيتوكروم التي الإسفار المنشط الخلية فرز تليها تحليلات ميكروأري يجري استخدامها لتحديد الجينات المسؤولة عن ردود فيتوكروم مكانية محددة.
Abstract
ضوء يتوسط مجموعة من العمليات التنموية والتكيف في جميع مراحل دورة حياة النبات. النباتات التي تمتص ضوء الاستفادة من جزيئات تسمى المستقبلات الضوئية الى الحس والتكيف مع الضوء. الأحمر / بعيدة الضوء الأحمر التي تمتص مبصرات فيتوكروم قد درست بشكل واسع. Phytochromes وجود له عائلة من البروتينات ذات وظائف مختلفة ومتداخلة في جميع النظم في النباتات الراقية التي تم دراستها<sup> 1</sup>. وغالبا ما تكون محلية ضوء ردود فيتوكروم بوساطة ، والتي تتراوح من إنبات البذور من خلال المزهرة والشيخوخة ، إلى الأنسجة النباتية أو أجهزة معينة<sup> 2</sup>. على الرغم من اكتشاف وتوضيح مهام فيتوكروم الفردية والمكرر من خلال تحليلات طفرية ، وتقارير دامغة على مواقع متميزة من إدراك الضوء والآليات الجزيئية للحمامات المترجمة من phytochromes التي تتوسط مكانية محدودة محددة ردود فيتوكروم. قمنا بتصميم التجارب على أساس فرضيات أن مواقع محددة من إدراك الضوء فيتوكروم تنظيم الأنسجة والأعضاء ، وجوانب محددة من تخلق ضوئي ، وأن تجمعات محلية فيتوكروم إشراك مجموعات فرعية متميزة من الجينات المستهدفة المصب في الخلية الى خلية الإشارة. طورنا نهجا انتقائيا للحد من البيوكيميائية phytochromes الوظيفية في الجهاز أو الأنسجة بطريقة معينة داخل النباتات المعدلة وراثيا. وتستند دراستنا على نهج محسن شرك الثنائية التي transactivation النتائج في التعبير عن الجين تحت سيطرة العنصر تنشيط التنقيب والإنتاج (UAS) تسلسل من منشط الترانسكربتي GAL4<sup> 3</sup>. وبيليفيردين اختزال (<em> BVR</em> يحتفظ بصمت) الجين تحت سيطرة UAS في غياب GAL4 transactivation في الأصل UAS – BVR<sup> 4</sup>. الصلبان الجينية المعدلة وراثيا بين خط UAS – BVR وفخ محسن GAL4 – GFP نتيجة سطر في التعبير محددة من<em> BVR</em> الجين في الخلايا التي تميزت<em> GFP</em> التعبير<sup> 4</sup>. BVR تراكم في نتائج النباتات Arabidopsis في عوز حامل اللون فيتوكروم<em> في بلانتا</em<sup> 5-7</sup>. وهكذا ، والنباتات المعدلة وراثيا التي تنتج لدينا معرض GAL4 التي تعتمد على تفعيل<em> BVR</em> الجينات ، مما أدى إلى تعطيل البيوكيميائية للفيتوكروم ، وكذلك تعتمد على GAL4<em> GFP</em> التعبير. التحليلات الوراثية والجزيئية بيولوجي ضوئي<em> BVR</em> خطوط المعدلة وراثيا تثمر التبصر في الأنسجة والأعضاء الخاصة فيتوكروم بوساطة الاستجابات التي ارتبطت مع المواقع المماثلة من إدراك الضوء<sup> 4 ، 7 ، 8</sup>. مضان الفرز الخلية المنشط (FACS) من GFP إيجابية ، محسن شرك المستحثة<em> BVR</emوتستخدم محطة protoplasts -> معربا عن مقرونا الخلية من نوع محدد التنميط الجيني التعبير من خلال تحليل ميكروأري لتحديد الجينات المستهدفة المفترضة المصب شارك في جهود الوساطة المكانية محددة ردود فيتوكروم. هذا البحث هو توسيع فهمنا للمواقع الإدراك الخفيفة ، والآليات التي من خلالها مختلف الأنسجة أو الأعضاء التعاون في نمو النبات ضوء التنظيم والتطوير ، والمضي قدما في تشريح الجزيئي للفيتوكروم بوساطة معقدة الخلية الى خلية يشير شلالات.
Protocol
Discussion
التنميط الجيني التعبير من خلال ميكروأرس (1) وأشارت إلى أن أكثر من 30 ٪ من الجينات في الشتلات Arabidopsis خفيفة وتنظيم 11 (2) وحددت مجموعة واسعة من جينات البروتينات الخفيفة ترميز نقل الإشارة المشاركة في تتالي إشارات فيتوكروم 12 و 13 . مثل هذه التجارب تشير إلى أن يدفع ضو…
Acknowledgements
ويدعم العمل في المختبر مونتغمري على ردود فيتوكروم في النباتات من قبل مؤسسة العلوم الوطنية (منحة رقم 0919100 للMCB – بلم) ، والعلوم الكيميائية ، علوم الأرض والعلوم البيولوجية شعبة ، ومكتب للعلوم الأساسية للطاقة ، ومكتب العلوم الأميركية ، وإدارة الطاقة (منحة رقم DE FG02 91ER20021 إلى بلم). نشكر ميليسا ويتيكر لتقديم المساعدة التقنية أثناء التصوير وقراءة نقدية للمخطوطة ، وستيفاني Costigan للحصول على المساعدة التجريبية ، والدكتور لويس الملك للمساعدة في تطوير وتحسين الإسفار المنشط خلية بروتوكولات لفرز الفرز الجبلة المجردة Arabidopsis والدكتور الإطار ميليندا للحصول على مساعدة مبائر المجهري. نشكر مارلين كاميرون عن المساعدة في التصميم الرسومية وكارين بيرد للمساعدة التحرير.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Anti-BVR antibody | QED Bioscience Inc. | 56257-100 | ||
| Cellulase “Onozuka” R-10 | SERVA Electrophoresis GmbH, Crescent Chemical Company | MSPC 0930 | ||
| Gamborg’s B5 basal salt mixture | Sigma | G5768 | ||
| Macerozyme R-10 | SERVA Electrophoresis GmbH, Crescent Chemical Company | PTC 001 | ||
| MES, low moisture content | Sigma | M3671 | ||
| Murashige and Skoog salts | Caisson Laboratories | 74904 | ||
| Phytablend | Caisson Laboratories | 28302 | ||
| RNeasy Plant Minikit | Qiagen | 16419 |
Referências
- Franklin, K. A., Quail, P. H. Phytochrome functions in Arabidopsis development. J. Exp. Bot. 61, 11-24 (2010).
- Montgomery, B. L. Right place, right time: Spatiotemporal light regulation of plant growth and development. Plant Signal Behav. 3, 1053-1060 (2008).
- Laplaze, L. GAL4-GFP enhancer trap lines for genetic manipulation of lateral root development in Arabidopsis thaliana. J. Exp. Bot. 56, 2433-2442 (2005).
- Costigan, S., Warnasooriya, S. N., Montgomery, B. L. Root-localized phytochrome chromophore synthesis is required for tissue-specific photoregulation of root elongation and impacts sensitivity to jasmonic acid in Arabidopsis thaliana. , .
- Lagarias, D. M., Crepeau, M. W., Maines, M. D., Lagarias, J. C. Regulation of photomorphogenesis by expression of mammalian biliverdin reductase in transgenic Arabidopsis plants. Plant Cell. , 675-688 (1997).
- Montgomery, B. L., Yeh, K. C., Crepeau, M. W., Lagarias, J. C. Modification of distinct aspects of photomorphogenesis via targeted expression of mammalian biliverdin reductase in transgenic Arabidopsis plants. Plant Physiol. 121, 629-639 (1999).
- Warnasooriya, S. N., Montgomery, B. L. Detection of spatial-specific phytochrome responses using targeted expression of biliverdin reductase in Arabidopsis. Plant Physiol. 149, 424-433 (2009).
- Warnasooriya, S. N., Porter, K. J., Montgomery, B. L. Light-dependent anthocyanin accumulation and phytochromes in Arabidopsis thaliana. , .
- Denecke, J., Vitale, A. The use of protoplasts to study protein synthesis and transport by the plant endomembrane system. Methods Cell Biol. 50, 335-348 (1995).
- Birnbaum, K. Cell type-specific expression profiling in plants via cell sorting of protoplasts from fluorescent reporter lines. Nat. Methods. 2, 615-619 (2005).
- Ma, L. Light control of Arabidopsis development entails coordinated regulation of genome expression and cellular pathways. Plant Cell. 13, 2589-2607 (2001).
- Chen, M., Chory, J., Fankhauser, C. Light signal transduction in higher plants. Annu. Rev. Genet. 38, 87-117 (2004).
- Ulm, R., &, N. a. g. y., F, . Signalling and gene regulation in response to ultraviolet light. Curr. Opin. Plant Biol. 8, 477-482 (2005).
- Ma, L. Organ-specific expression of Arabidopsis genome during development. Plant Physiol. 138, 80-91 (2005).
- Neff, M. M., Fankhauser, C., &, C. h. o. r. y., J, . Light: an indicator of time and place. Genes Dev. 14, 257-271 (2000).
- Birnbaum, K. A gene expression map of the Arabidopsis root. Science. 302, 1956-1960 (2003).
