Étude des tissus et des organes spécifiques Réponses phytochrome utilisant FACS assistée type cellulaire profilage expression spécifique dans Arabidopsis thaliana</em
Summary
La base moléculaire de l'espace des réponses spécifiques phytochrome est étudiée en utilisant des plantes transgéniques qui présentent des tissus et des organes spécifiques déficiences phytochrome. L'isolement des cellules spécifiques présentant induite par la déplétion chromophore phytochrome Fluorescence-Activated tri cellulaire suivie par des analyses microarray est utilisée pour identifier les gènes impliqués dans les réponses phytochrome spatiale spécifique.
Abstract
Médie lumière un éventail de processus de développement et d'adaptation tout au long du cycle de vie d'une plante. Les plantes utilisent la lumière d'absorption des molécules appelées photorécepteurs de détecter et de s'adapter à la lumière. Le rouge / rouge lointain absorbant la lumière photorécepteurs phytochrome ont été largement étudiés. Phytochromes exister comme une famille de protéines ayant des fonctions distinctes et qui se chevauchent dans tous les systèmes de plantes supérieures dans lesquelles ils ont été étudiés<sup> 1</sup>. Réponses lumière phytochrome médiation, qui vont de la germination des graines grâce à la floraison et la sénescence, sont souvent localisées dans les tissus des plantes ou des organes<sup> 2</sup>. Malgré la découverte et l'élucidation de l'individu et redondants fonctions phytochrome par des analyses de mutation, des rapports concluants sur des sites distincts de photoperception et les mécanismes moléculaires de piscines localisées de phytochromes qui interviennent dans l'espace des réponses spécifiques phytochrome sont limitées. Nous avons conçu des expériences basées sur l'hypothèse que des sites spécifiques du phytochrome photoperception réguler les tissus et les organes aspects spécifiques de la photomorphogenèse, et que les piscines localisées phytochrome s'engager sous-ensembles distincts de gènes cibles en aval de la cellule à cellule de signalisation. Nous avons développé une approche biochimique pour réduire sélectivement phytochromes fonctionnelle dans un organe ou un tissu-spécifique de façon sein des plantes transgéniques. Nos études sont basées sur un bipartites enhancer-trap démarche qui aboutit à la transactivation de l'expression d'un gène sous le contrôle de la séquence d'activation en amont (UAS) élément par l'activateur transcriptionnel GAL4<sup> 3</sup>. La biliverdine réductase (<em> BVR</em> Gène) sous le contrôle de la SAMU est silencieusement maintenu en l'absence de transactivation de GAL4 dans la relation parent-UAS BVR<sup> 4</sup>. Croisements génétiques entre une ligne SAMU-BVR transgéniques et un résultat GAL4-GFP enhancer ligne de trappe dans l'expression spécifique de la<em> BVR</emGénique> dans les cellules marquées par<em> GFP</em> Expression<sup> 4</sup>. L'accumulation BVR dans les résultats des plantes d'Arabidopsis en carence chromophore phytochrome<em> In planta</em<sup> 5-7</sup>. Ainsi, les plantes transgéniques que nous avons produit la pièce GAL4-dépendante l'activation de la<em> BVR</emGénique>, ce qui entraîne l'inactivation biochimique du phytochrome, ainsi que GAL4-dépendant<em> GFP</em> Expression. Photobiologiques et des analyses génétiques moléculaires de<em> BVR</em> Lignées transgéniques qui nous donnent des tissus et des organes spécifiques phytochrome réponses à médiation qui ont été associés avec les sites correspondants de photoperception<sup> 4, 7, 8</sup>. Fluorescence tri cellulaire (FACS) de la GFP-positives, enhancer-trap-induite<em> BVR</emProtoplastes végétaux> exprimant couplé avec un type de cellule spécifique profilage de l'expression de gènes par l'analyse des microréseaux est utilisé pour identifier les gènes putatifs cible en aval impliquées dans la médiation spatiale des réponses spécifiques phytochrome. Cette recherche est l'expansion de notre compréhension des sites de perception de la lumière, les mécanismes par lesquels les différents tissus ou d'organes coopèrent dans la croissance des plantes lumière réglementés et le développement, et de faire progresser la dissection moléculaire des complexes phytochrome médiation de cellule à cellule cascades de signalisation.
Protocol
Discussion
Profilage de l'expression de gènes par puces à ADN (1) a indiqué que plus de 30% des gènes dans des plants d'Arabidopsis sont réglementés et de lumière 11 (2) a identifié un vaste groupe de gènes codant des protéines de transduction du signal lumineux impliqués dans la cascade de signalisation phytochrome 12, 13 . De telles expériences suggèrent que la lumière induit des changements rapides et à long terme dans l'expression des gènes. Chaque pool de phytochromes peut con…
Acknowledgements
Le travail dans le laboratoire de Montgomery sur les réponses phytochrome dans les plantes est soutenue par la National Science Foundation (subvention aucune. MCB-0919100 au BLM) et les sciences chimiques, sciences de la terre et les sciences biologiques, Bureau des sciences fondamentales de l'énergie, Bureau des sciences, Département américain de Energie (subvention aucune. DE FG02 91ER20021 au BLM). Nous tenons à remercier Melissa Whitaker pour l'assistance technique pendant le tournage et la lecture critique du manuscrit, Stéphanie Costigan à l'aide d'expérimentation, le Dr Louis roi de l'aide pour développer et optimiser Fluorescence-Activated tri cellulaire protocoles pour le tri des protoplastes d'Arabidopsis et le Dr Melinda cadre de l'aide pour confocale microscopie. Nous tenons à remercier Marlene Cameron pour l'assistance de conception graphique et Bird Karen pour son assistance éditoriale.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Anti-BVR antibody | QED Bioscience Inc. | 56257-100 | ||
| Cellulase “Onozuka” R-10 | SERVA Electrophoresis GmbH, Crescent Chemical Company | MSPC 0930 | ||
| Gamborg’s B5 basal salt mixture | Sigma | G5768 | ||
| Macerozyme R-10 | SERVA Electrophoresis GmbH, Crescent Chemical Company | PTC 001 | ||
| MES, low moisture content | Sigma | M3671 | ||
| Murashige and Skoog salts | Caisson Laboratories | 74904 | ||
| Phytablend | Caisson Laboratories | 28302 | ||
| RNeasy Plant Minikit | Qiagen | 16419 |
Referências
- Franklin, K. A., Quail, P. H. Phytochrome functions in Arabidopsis development. J. Exp. Bot. 61, 11-24 (2010).
- Montgomery, B. L. Right place, right time: Spatiotemporal light regulation of plant growth and development. Plant Signal Behav. 3, 1053-1060 (2008).
- Laplaze, L. GAL4-GFP enhancer trap lines for genetic manipulation of lateral root development in Arabidopsis thaliana. J. Exp. Bot. 56, 2433-2442 (2005).
- Costigan, S., Warnasooriya, S. N., Montgomery, B. L. Root-localized phytochrome chromophore synthesis is required for tissue-specific photoregulation of root elongation and impacts sensitivity to jasmonic acid in Arabidopsis thaliana. , .
- Lagarias, D. M., Crepeau, M. W., Maines, M. D., Lagarias, J. C. Regulation of photomorphogenesis by expression of mammalian biliverdin reductase in transgenic Arabidopsis plants. Plant Cell. , 675-688 (1997).
- Montgomery, B. L., Yeh, K. C., Crepeau, M. W., Lagarias, J. C. Modification of distinct aspects of photomorphogenesis via targeted expression of mammalian biliverdin reductase in transgenic Arabidopsis plants. Plant Physiol. 121, 629-639 (1999).
- Warnasooriya, S. N., Montgomery, B. L. Detection of spatial-specific phytochrome responses using targeted expression of biliverdin reductase in Arabidopsis. Plant Physiol. 149, 424-433 (2009).
- Warnasooriya, S. N., Porter, K. J., Montgomery, B. L. Light-dependent anthocyanin accumulation and phytochromes in Arabidopsis thaliana. , .
- Denecke, J., Vitale, A. The use of protoplasts to study protein synthesis and transport by the plant endomembrane system. Methods Cell Biol. 50, 335-348 (1995).
- Birnbaum, K. Cell type-specific expression profiling in plants via cell sorting of protoplasts from fluorescent reporter lines. Nat. Methods. 2, 615-619 (2005).
- Ma, L. Light control of Arabidopsis development entails coordinated regulation of genome expression and cellular pathways. Plant Cell. 13, 2589-2607 (2001).
- Chen, M., Chory, J., Fankhauser, C. Light signal transduction in higher plants. Annu. Rev. Genet. 38, 87-117 (2004).
- Ulm, R., &, N. a. g. y., F, . Signalling and gene regulation in response to ultraviolet light. Curr. Opin. Plant Biol. 8, 477-482 (2005).
- Ma, L. Organ-specific expression of Arabidopsis genome during development. Plant Physiol. 138, 80-91 (2005).
- Neff, M. M., Fankhauser, C., &, C. h. o. r. y., J, . Light: an indicator of time and place. Genes Dev. 14, 257-271 (2000).
- Birnbaum, K. A gene expression map of the Arabidopsis root. Science. 302, 1956-1960 (2003).
