Summary
Здесь сообщается о системе изучения коллективного поведения нематод путем их культивирования в больших количествах с использованием пищевой агаровой среды для собак. Эта система позволяет исследователям размножать большое количество червей Дауэра и может быть применена к Caenorhabditis elegans и другим родственным видам.
Abstract
Животные демонстрируют динамичное коллективное поведение, которое наблюдается в стаях птиц, косяках рыб и толпах людей. Коллективное поведение животных было исследовано как в области биологии, так и в области физики. В лаборатории исследователи использовали различных модельных животных, таких как плодовая муха и рыбка данио, в течение примерно столетия, но изучение крупномасштабного сложного коллективного поведения, организованного этими генетически управляемыми модельными животными, оставалось серьезной проблемой. В данной работе представлен протокол создания экспериментальной системы коллективного поведения у Caenorhabditis elegans. Размножающиеся черви взбираются на крышку пластины Петри и демонстрируют коллективное роение. Система также контролирует взаимодействие и поведение червей, изменяя влажность и световую стимуляцию. Эта система позволяет нам исследовать механизмы, лежащие в основе коллективного поведения, изменяя условия окружающей среды, и изучать влияние локомоции на индивидуальном уровне на коллективное поведение с использованием мутантов. Таким образом, система полезна для будущих исследований как в физике, так и в биологии.
Introduction
Как неученые, так и ученые очарованы коллективным поведением животных, например, стаями птиц и косяками рыб. Коллективное поведение было проанализировано в широком спектре областей, включая физику, биологию, математику и робототехнику. В частности, физика активной материи является растущей областью исследований, которая фокусируется на системах, состоящих из самодвижущихся элементов, то есть диссипативных систем, таких как стаи птиц, косяки рыб, биопленки подвижных бактерий, цитоскелеты, состоящие из активных молекул, группы самодвижущихся коллоидов. Теория физики активной материи утверждает, что каким бы сложным ни было поведение индивидуумов, коллективные движения огромного числа живых существ управляются небольшим числом простых правил. Например, модель Вичсека, кандидат на унифицированное описание коллективного движения самодвижущихся частиц, предсказывает, что для формирования дальней упорядоченной фазы с эксцентрическими флуктуациями в 2D, как в стадахживотных1, требуется ближнедальнее взаимодействие выравнивания движущихся объектов. Быстрыми темпами развиваются нисходящие экспериментальные подходы к физике активной материи. Предыдущие эксперименты подтвердили образование дальнодействующей упорядоченной фазы у Escherichiacoli 2. В других недавних работах использовались клетки 3,4, бактерии5, подвижные коллоиды6 или движущиеся белки 7,8. Простые минимальные модели, такие как модель Вичсека, успешно описывают эти реальные явления. В отличие от этих одноклеточных экспериментальных систем, коллективное поведение животных обычно наблюдается в дикой природе, так как никто не может надеяться провести контролируемые эксперименты с 10 000 реальных птиц или рыб.
Биологи разделяют тот же интерес, что и физики: как люди взаимодействуют друг с другом и функционально ведут себя как группа. Одной из традиционных областей исследований для анализа индивидуального поведения является нейронаука, в которой механизмы, лежащие в основе поведения, изучаются на нейронном и молекулярном уровнях. К настоящему времени было разработано множество нейробиологических подходов, основанных на принципе «снизу вверх». Нисходящий подход в физике и восходящий подход в биологии могут быть реализованы с помощью модельных животных, таких как плодовая мушка, червь Caenorhabditis elegans и мышь9. Тем не менее,в лаборатории было получено мало данных о крупномасштабном коллективном поведении этих модельных животных; До сих пор сложно в лабораторных условиях получить генетически поддающихся модельных животных в больших масштабах. Поэтому в современных исследованиях коллективного поведения в биологии и физике ученым, которые обычно проводят исследования в лаборатории, было трудно изучать коллективное поведение животных.
В этом исследовании мы разработали метод крупномасштабного культивирования нематод для изучения их коллективного поведения. Эта система позволяет изменять условия окружающей среды и изучать влияние локомоции на индивидуальном уровне на коллективное поведение с использованием мутантов10. В физике активной материи параметрами математической модели можно управлять как в экспериментах, так и в симуляциях, что позволяет верифицировать эту модель для выявления унифицированных описаний. Генетика используется для понимания механизма нейронных цепей, лежащих в основе коллективного поведения11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Заготовка глистов
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте штаммы N2 Bristol12 и ZX899 дикого типа (lite-1(ce314); ljIs123[mec-4p::ChR2, unc-122p::RFP])13 для наблюдения за коллективным поведением и оптогенетических экспериментов соответственно. Сохраняйте штамм ZX899 в темноте.
- Поместить четырех хорошо упитанных взрослых червей на 60-миллиметровую пластину, содержащую 14 мл питательной среды нематоды (НГМ) с агаром и засеянную E. coli OP5012.
- Выращивайте червей F1 до голодной смерти в планшете NGM при температуре 23 °C в течение 7 дней. Урожайность червей F1 на данный момент составляет примерно 100 червей на пластину. Стадии червей состоят из смешанной популяции личинок L1.
2. Приготовление агара для собак (ДФА) средних тарелок
- Автоклавируйте стеклянную бутылку, содержащую 2 г порошкообразного корма для собак и 5 мл 1% агаровой среды, и охладите ее до комнатной температуры (рисунок 1А).
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте можно использовать другие корма для собак от разных производителей.
3. Посев червей на пластины среды ДФА
- Перенесите небольшое количество (примерно 0,5 г) среды DFA в центр планшета NGM, засеянного E. coli OP50 (Рисунок 1B). Для оптогенетических экспериментов перед инокуляцией червей наливают 40 мкл 50 мкМ полностью транс-ретиналь, кофактора канального родопсина 2, на ДФА.
- Соберите истощенных червей с четырех пластин NGM, используя автоклавную воду.
- Поместите небольшой фрагмент собачьего корма (примерно 0,5 г) на среду DFA на расстоянии примерно 2 мм от крышки тарелки.
- Осветите пластину NGM ультрафиолетовым светом в течение 15 минут внутри чистого стола, чтобы предотвратить загрязнение.
- Высейте собранных червей (примерно 400 червей) в среду DFA на планшетах NGM. Не закрывайте планшет парапленкой, чтобы избежать повышения влажности внутри чашки Петри и образования капель воды, которые задерживают червей на крышке.
- Размножайте червей при температуре 23 °C и дайте им подняться до крышки тарелки примерно 10-14 дней.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку количество червей на крышках почти не увеличивалось через 10-14 дней, предполагалось, что у червей, вероятно, закончилась пища.
4. Наблюдение за коллективным поведением
- В день эксперимента поместите новую планшет NGM, не содержащую кишечную палочку и агаровую среду для собачьего корма, на алюминиевую пластину на предметном столике микроскопа с макрозумом (рис. 2А). Держите нижнюю часть этой новой пластины NGM при температуре 23 °C с помощью регулятора температуры Пельтье не менее 5 минут (Рисунок 2B). Затем замените крышку этой новой пластины NGM крышкой пластины, на которую забрались черви. Используйте объектив (x2, NA = 0,5) в качестве объектива с малым увеличением (Рисунок 2A).
- Увеличьте температуру нижней части чашки Петри с 23 °C до 26 °C, чтобы изменить влажность внутри этой чашки (Рисунок 2).
- Получение изображений внутренней поверхности крышки пластины с помощью камеры на 20 кадрах с−1 (дополнительное видео S1).
- Сохраните полученные изображения в формате Tagged Image File.
5. Оптогенетический эксперимент
- Используйте ртутную лампу мощностью 100 Вт для подачи синего света, отфильтрованного с помощью набора фильтров. Точно контролируйте время освещения с помощью электромагнитной системы затворов (рис. 2B).
- Поддерживайте ZX899 на DFA в этих условиях в течение 5 минут до загорания синего света.
- Осветите червей ZX899, прикрепленных к крышке планшета Петри на предметном столике микроскопа, поддерживаемом при температуре 23 °C.
- Получение изображений внутренней поверхности крышки пластины с помощью камеры в режиме 20 кадров с−1 (дополнительное видео S2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Здесь для коллективных наблюдений за поведением использовались черви Дауэра дикого типа. Червей культивировали при температуре 23 °C в течение примерно 10-14 дней и взбирались на внутреннюю поверхность крышки средней пластины DFA. В экспериментальный день только крышку переносили на новую пластину NGM без кишечной палочки и среды DFA. Дно этой чашки Петри первоначально поддерживалось при температуре 23 °C с помощью системы Пельтье, а затем его температура была увеличена до 26 °C. Под микроскопом был снят фильм. На рисунке 3 показаны снимки фильма. Черви динамически перестраивали свою сеть при изменении влажности. По мере увеличения влажности размеры отсеков сети также становятся больше. В конце концов сети схлопнулись, а на внутренней поверхности крышки остались спящие скопления червей.
Рисунок 1: Фотографии среды ДФА для культивирования большого количества червей. (А) Фотография среды ДФА, приготовленной в стеклянной бутылке. (B) Фотография планшета NGM со средой DFA сразу после того, как собранные черви были инокулированы. Аббревиатуры: DFA = агар для собачьего корма; NGM = питательная среда нематоды. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Экспериментальная система для наблюдения за коллективным поведением. (А) Микроскопия для наблюдения за коллективным поведением. (B) Механический контроллер затвора и система контроля температуры с использованием системы Пельтье. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Репрезентативные данные о зависимости коллективного сетевого паттерна от влажности. Зависимость сети C. elegans от влажности окружающей среды. Частота кадров камеры составляет 1 кадр в секунду. Масштабная линейка = 4 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительное видео S1: Формирование коллективных сетей. Червей Дауэра дикого типа размножали с помощью ДФА на НГМ в планшете Петри. Черви самоорганизовались внутри крышки. Влажность изменяли с помощью прибора Пельтье. Снимки были сделаны сверху крышки. Видеоролик воспроизводится в 80 раз быстрее, чем скорость записи в реальном времени. Аббревиатуры: DFA = агар для собачьего корма; NGM = питательная среда нематоды. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Дополнительное видео S2: Оптогенетическое манипулирование коллективами червей. Оптогенетику проводили при освещении синим светом 1, 2, 4, 8, 32 и 128 с. Эта активация первоначально вызывала арборизацию и разрушение связок. В итоге сформировалась сеть, отличная от первоначальной структуры. Видеоролик воспроизводится в 20 раз быстрее, чем скорость записи в реальном времени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В данном исследовании мы показываем протокол подготовки системы для крупномасштабного коллективного поведения C. elegans в лабораторных условиях. Метод, основанный на DFA, был первоначально разработан для Caenorhabditis japonica14 и Neoaplectana carpocapsae Weiser15, которые не являются модельными животными. Однако этот метод не применялся для исследования коллективного поведения. C. elegans является генетически поддающимся работе модельным животным11,12. Поведенческие генетические исследования с использованием C. elegans внесли свой вклад в изучение поведенческих исследований на индивидуальном уровне. Тем не менее, за долгую историю исследований C. elegans, несмотря на то, что наблюдался простой паттерн скопления 16,17,18,19, ни одно сообщение не продемонстрировало динамическое формирование паттерна через поведение C. elegans на уровне группы. Ключевой идеей этого исследования является использование среды DFA для облегчения поддержания огромного количества червей в течение длительного времени в чашке Петри. Используя среду DFA, мы представляем наблюдение за динамическим коллективным поведением C. elegans, тем самым вводя новую поведенческую парадигму.
Ранее сообщалось о нескольких методах массового производства червей. По сравнению с этими методами, преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет исследовать коллективное поведение на крышке без процесса выделения червей Дауэра. Недавно мы опубликовали статью, в которой сообщалось о переносе мигательных червей Дауэра через зазор между крышкой и средой DFA с помощью электростатического взаимодействия с крышкой20. Этот перенос червей происходит, когда черви образуют столбик, состоящий примерно из 100 червей. Это исследование показывает, что только черви Дауэра могут переноситься, когда образования Дауэра индуцируются слишком большой скученностью в DFA. Количество червей, полученных с помощью этого метода, вероятно, меньше, чем у других методов, таких как методы, основанные на яичном желтке. Тем не менее, для проведения поведенческого анализа на крышке мы можем использовать популяцию червей Дауэра, которая вряд ли включает червей других стадий, таких как истощенные личинки L1, в то время как предыдущие методы требовали процесса выделения червей Дауэра. Таким образом, данный метод позволяет проводить более точное коллективное исследование поведения с использованием червей Дауэра. Кроме того, экспериментатор также может контролировать плотность червей в следующей процедуре. Сначала автоклавная вода использовалась для сбора и промывки червей, которые перемещались к крышке. Затем концентрацию червей в воде определяли путем подсчета червей в аликвоте червячной суспензии, и червячную суспензию сбрасывали на субстрат. В совокупности наша система более управляема с точки зрения стадии червя и плотности для поведенческих экспериментов.
Коллективное поведение анализируется с точки зрения физики активной материи, стремящейся выявить унифицированные описания коллективных движений живых и неживых самодвижущихся частиц. Для достижения этой цели было разработано множество экспериментальных систем для неживых самодвижущихся частиц и клеток, но меньше систем было разработано для многоклеточных организмов, которые демонстрируют гораздо более сложное поведение, основанное на нейронной цепи. Таким образом, наша система расширяет возможность существования единого описания коллективных движений. Что касается манипуляций с влажностью, наше предыдущее численное моделирование, основанное на модели, показало, что силы притяжения между червями, вероятно, вызванные влажностью в эксперименте, вызывают изменения рисунка, которые качественно согласуютсяс изменениями рисунка, вызванными влажностью. Тем не менее, мы считаем, что нет никаких детерминированных экспериментальных данных, показывающих, что изменения паттерна были вызваны влажностью, а не температурой. Поэтому экспериментатор должен проявлять осторожность в отношении того, могут ли изменения коллективного поведения быть отнесены исключительно к изменению влажности, а не к изменению температуры.
Понимание нейронного механизма, лежащего в основе коллективного поведения у животных, является новой задачей в области биологии. Коллективное поведение приводит к возникновению новой функции, которая не проявляется на индивидуальном уровне. Поскольку у животных есть нервная система, они обладают памятью и способностями к обучению, и интересно изучить различия в этих нейронных функциях на индивидуальном и популяционном уровнях. Было отмечено, что коллективное поведение повышает чувствительность обнаружения чужеродных организмов и добычи и повышает способность к принятию правильных решений 21,22,23. C. elegans также имеет нервную систему, состоящую из 302 нейронов, и, таким образом, запоминает прошлую температуру культивирования24 и мигрирует в место с предпочтительной влажностью25. Таким образом, было бы интересно исследовать взаимосвязь между нервными функциями и коллективным поведением у C. elegans. Кроме того, можно рассчитывать на извлечение механических параметров путем наблюдения за поведением популяции червей. Например, наблюдение за вязкоупругими свойствами в скоплениях C. elegans позволило бы оценить упругость одного червя и поверхностное натяжение между червями. Распределение по размерам скоплений червей должно быть связано с поверхностным натяжением между ними. Движущая сила особи C. elegans также может быть оценена по частоте, с которой червь выдвигается в ответ на поверхностное натяжение. Таким образом, можно рассчитывать на оценку механических параметров на уровне отдельных червей только на основе макроскопической информации о популяции червей.
В заключение следует отметить, что физика активной материи нацелена на выявление унифицированных описаний коллективного поведения, и эта область требует дополнительной экспериментальной проверки предложенных математических моделей с помощью управляющих параметров. Кроме того, функциональная значимость формирования коллективного паттерна каждого животного и его механическая значимость для нейронных функций являются важными открытыми вопросами. Кроме того, учитывая, что одной из целей «мягкой робототехники» является точное управление коллективами роботов, мы надеемся, что с помощью экспериментов коллективного поведения червей может быть создан алгоритм для применения к управлению коллективными движениями мягких роботов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявлять.
Acknowledgments
Мы благодарим Генетический центр Caenorhabditis за предоставленные штаммы, использованные в этом исследовании. Данная публикация была поддержана JSPS KAKENHI Grant-in-Aid for Scientific Research (B) (номер гранта JP21H02532), JSPS KAKENHI Grant-in-Aid по проекту инновационных областей «Наука о мягком роботе» (грант No JP18H05474), JSPS KAKENHI Grant-in-Aid for Transformative Research Areas B (грант No JP23H03845), PRIME от Японского агентства медицинских исследований и разработок (номер гранта JP22gm6110022h9904), JST-Mirai Program (грант No JPMJMI22G3), и программа JST-FOREST (грант No JPMJFR214R).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Escherichia coli and C. elegans strains | |||
| E. coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | Food for C. elegans. Uracil auxotroph. E. coli B. |
| lite-1(ce314); ljIs123[mec-4p::ChR2, unc-122p::RFP] | author | ZX899 | lite-1(ce314) mutant carrying the genes expressing ChR2 and RFP under the control of the mec-4 and unc-122 promoter, respectively |
| N2 Bristrol | Caenorhabditis Genetics Center | Wild-type C. elegans strain | |
| For worm cultivation | |||
| Agar purified, powder | Nakarai tesque | 01162-15 | For preparation of NGM plates |
| All-trans retinal | Sigma-Aldrich | R2500 | For optogenetics |
| Bacto pepton | Becton Dickinson | 211677 | For preparation of NGM plates |
| Calcium chloride | Wako | 036-00485 | For preparation of NGM plates |
| Cholesterol | Wako | 034-03002 | For preparation of NGM plates |
| di-Photassium hydrogenphosphate | Nakarai tesque | 28727-95 | For preparation of NGM plates |
| Dog food | Nihon Pet Food | VITA-ONE | For preparation of dog food agar medium |
| LB broth, Lennox | Nakarai tesque | 20066-95 | For culture of E. coli OP50 |
| Magnesium sulfate anhydrous | TGI | M1890 | For preparation of NGM plates |
| Petri dishes (60 mm) | Nunc | 150270 | For preparation of NGM plates |
| Potassium Dihydrogenphosphate | Nakarai tesque | 28720-65 | For preparation of NGM plates |
| Sodium Chloride | Nakarai tesque | 31320-05 | For preparation of NGM plates |
| Observation | |||
| Computer | CT solution | CS6229 | Windows10 Pro with Intel Xeon Gold 6238R CPU and 768 GB of RAM |
| CMOS Camera | Hamamatsu photonics | ORCA-Lightning C14120-20P | For data acquisition |
| CMOS Camera | Olympus | DP74 | For data acquisition |
| Microscope with SZX-MGFP set | Olympus | MVX10 | For data acquisition |
| x2 Objective lens | Olympus | MV PLAPO 2XC | Working distance 20 mm and numerical aperture 0.5 |
| Shutter control | |||
| Shutter | OptoSigma | BSH2-RIX | For controlling temporal pattern of light illumination |
| Shutter controller | OptoSigma | SSH-C2B-A | For controlling temporal pattern of light illumination |
| Temperature control | |||
| Peltier temperature controller unit | VICS | WLVPU-30 | For controlling humidity inside a Petri plate |
| UNI-THEMO CONTROLLER | Ampere | UTC-100 | For controlling humidity inside a Petri plate |
| Data acquisition software | |||
| HCImage | Hamamatsu photonics | For data acquisition |
References
- Vicsek, T., Czirók, A., Ben-Jacob, E., Cohen, I., Shochet, O. Novel type of phase transition in a system of self-driven particles. Physical Review Letters. 75 (6), 1226-1229 (1995).
- Nishiguchi, D., Nagai, K. H., Chaté, H., Sano, M. Long-range nematic order and anomalous fluctuations in suspensions of swimming filamentous bacteria. Physical Review E. 95 (2), 020601-020606 (2017).
- Saw, T. B., et al. Topological defects in epithelia govern cell death and extrusion. Nature. 544 (7649), 212-216 (2017).
- Kawaguchi, K., Kageyama, R., Sano, M. Topological defects control collective dynamics in neural progenitor cell cultures. Nature. 545 (7654), 327-331 (2017).
- Chen, C., Liu, S., Shi, X., Chaté, H., Wu, Y. Weak synchronization and large-scale collective oscillation in dense bacterial suspensions. Nature. 542 (7640), 210-214 (2017).
- Bricard, A., Caussin, J. -B., Desreumaux, N., Dauchot, O., Bartolo, D. Emergence of macroscopic directed motion in populations of motile colloids. Nature. 503 (7474), 95-98 (2013).
- Sumino, Y., et al. Large-scale vortex lattice emerging from collectively moving microtubules. Nature. 483 (7390), 448-452 (2012).
- Schaller, V., Weber, C., Semmrich, C., Frey, E., Bausch, A. R.
- Lin, A., et al. Imaging whole-brain activity to understand behaviour. Nature Reviews Physics. 4 (5), 292-305 (2022).
- Sugi, T., Ito, H., Nishimura, M., Nagai, K. H. C. elegans collectively forms dynamical networks. Nature Communications. 10 (1), 1-9 (2019).
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: a primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).
- Brenner, S.
- Stirman, J. N., et al. Real-time multimodal optical control of neurons and muscles in freely behaving Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 8 (2), 153-158 (2011).
- Tanaka, R., Okumura, E., Yoshiga, T. A simple method to collect phoretically active dauer larvae of Caenorhabditis japonica. Nematological Research. 40 (1), 7-12 (2010).
- Hara, A. H., Lindegren, J. E., Kaya, H. K. Monoxenic mass production of the entomogenous nematode Neoaplectana carpocapsae. Weiser on dog food/agar medium. 16, 1-8 (1981).
- de Bono, M., Bargmann, C. I. Natural variation in a neuropeptide Y receptor homolog modifies social behavior and food response in C. elegans. Cell. 94 (5), 679-689 (1998).
- Artyukhin, A. B., Yim, J. J., Cheong, M. C., Avery, L.
- Ding, S. S., Schumacher, L. J., Javer, A. E., Endres, R. G., Brown, A. E. Shared behavioral mechanisms underlie C. elegans aggregation and swarming. eLife. 8, 1181 (2019).
- Chen, Y., Ferrell, J. E. C. elegans colony formation as a condensation phenomenon. Nature Communications. 12 (1), 4947 (2021).
- Chiba, T., et al. Caenorhabditis elegans transfers across a gap under an electric field as dispersal behavior. Current Biology. 33 (13), 2668-2677 (2023).
- Ioannou, C. C., Guttal, V., Couzin, I. D. Predatory fish select for coordinated collective motion in virtual prey. Science. 337 (6099), 1212-1215 (2012).
- Couzin, I. D., Krause, J., Franks, N. R., Levin, S. A. Effective leadership and decision-making in animal groups on the move. Nature. 433 (7025), 513-516 (2005).
- Sumpter, D. J. T., Krause, J., James, R., Couzin, I. D., Ward, A. J. W. Consensus decision making by fish. Current Biology: CB. 18 (22), 1773-1777 (2008).
- Sugi, T., Nishida, Y., Mori, I. Regulation of behavioral plasticity by systemic temperature signaling in Caenorhabditis elegans. Nature Neuroscience. 14 (8), 984-992 (2011).
- Russell, J., Vidal-Gadea, A. G., Makay, A., Lanam, C., Pierce-Shimomura, J. T. Humidity sensation requires both mechanosensory and thermosensory pathways in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 8269-8274 (2014).
