Grands écrans des banques métagénomiques
Abstract
Métagénomique fragments bibliothèques grande archive de séquences génomiques contiguës à partir de microorganismes sans nécessiter de culture préalable. Génération d'une procédure simplifiée pour la création et le criblage de métagénomique est donc utile pour l'efficacité à haut débit des enquêtes sur les propriétés génétiques et métaboliques des assemblages microbiens incultes. Ici, les protocoles clés sont présentés sur vidéo, que nous proposons est le format le plus utile pour décrire avec précision un long processus qui dépend alternativement sur l'instrumentation et les interventions manuelles robotisées (humain). Premièrement, nous avons utilisé la robotique de repérer les clones de bibliothèques sur des membranes macroarray haute densité, dont chacune peut contenir des colonies reproduire vingt à quatre plaques bibliothèque de 384 puits. L'automatisation est essentielle pour cette procédure non seulement pour la précision et la vitesse, mais aussi en raison de la miniaturisation d'échelle nécessaires pour s'adapter au grand nombre de clones de la banque en très dense arrangements spatiaux. Une fois produite, nous avons ensuite montré comment les membranes macroarray peuvent être criblés pour des gènes d'intérêt en utilisant des versions modifiées des protocoles standard pour l'étiquetage de sonde, l'hybridation membrane, et la détection du signal. Nous avons complété la démonstration visuelle de ces procédures avec des descriptions détaillées écrite des étapes et le matériel requis, qui sont tous disponibles en ligne aux côtés de la vidéo.
Protocol
Discussion
La procédure de dépouillement n'a pas été optimisée. Toutefois, la procédure de décapage donné dans les instructions du fabricant (2 lavages chacun, 10 min dans de l'éthanol à 100%, 1 lavage de 1 h à 60 ° C dans du SDS 0,5%) est insuffisant. Au moins une nuit d'incubation dans de l'éthanol à 100% est nécessaire pour dissoudre le produit de la réaction ECF, plusieurs jours d'incubation dans de l'éthanol à 100% ne semble pas avoir d'effets néfastes sur l'aptitude à reprobe la membrane. Le fa…
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| AlkPhos Direct Labelling Reagents | kit | Amersham | RPN3680 | Contains labeling reagent, cross-linker solution, reaction buffer, water, control DNA, hybridization buffer, blocking reagent. Store hybridization buffer and blocking reagent at room temperature, other reagents at 2-8°C. |
| ECF Substrate | kit | Amersham | RPN3685 | Contains ECF substrate, ECF substrate dilution buffer. Note: Pack contains total 60 ml reagent; aliquot into 10 ml samples in Falcon tube and store at 20°C. Use about 10 ml per membrane (size of 22 by 22 cm). |
| 20x Secondary Wash Buffer | buffer | 121 g Tris (final 1 M), 117 g NaCl (final 2 M). Adjust pH to 10. Adjust to 1 L with water. Store at 2-8°C for up to 4 months. | ||
| 0.5 M NaH2PO4 buffer pH 7 | buffer | 69 g NaH2PO4.H2O. Adjust pH to 7 with NaOH. Adjust to 1 L with water. Store at room temperature. | ||
| 1 M MgCl2 | 50.8 g MgCl2.6H2O Adjust to 250 ml with water. Store at room temperature. | |||
| 10% (w/v) SDS | 20 g SDS Adjust to 200 ml with water. Store at room temperatur |
