Summary
När den integreras med en huvudplatta och en optisk design som är kompatibel med både en- och tvåfotonmikroskop, ger mikroprismalinsen en betydande fördel när det gäller att mäta neurala svar i en vertikal kolumn under olika förhållanden, inklusive välkontrollerade experiment i huvudfixerade tillstånd eller naturliga beteendeuppgifter hos fritt rörliga djur.
Abstract
Med utvecklingen av multifotonmikroskopi och molekylära tekniker växer fluorescensavbildning snabbt till att bli en kraftfull metod för att studera strukturen, funktionen och plasticiteten hos levande hjärnvävnader. I jämförelse med konventionell elektrofysiologi kan fluorescensmikroskopi fånga cellernas neurala aktivitet såväl som morfologi, vilket möjliggör långtidsregistreringar av de identifierade neuronpopulationerna med encellig eller subcellulär upplösning. Högupplöst avbildning kräver dock vanligtvis en stabil, huvudfixerad uppställning som begränsar djurets rörelse, och beredningen av en plan yta av genomskinligt glas möjliggör visualisering av neuroner i ett eller flera horisontella plan men är begränsad när det gäller att studera de vertikala processer som löper över olika djup. Här beskriver vi en procedur för att kombinera en huvudplattfixering och ett mikroprisma som ger flerskikts- och multimodal avbildning. Detta kirurgiska preparat ger inte bara tillgång till hela kolumnen i musens visuella cortex utan möjliggör tvåfotonavbildning i en huvudfixerad position och enfotonavbildning i ett fritt rörligt paradigm. Med hjälp av detta tillvägagångssätt kan man ta prover på identifierade cellpopulationer över olika kortikala lager, registrera deras svar under huvudfixerade och fritt rörliga tillstånd och spåra de långsiktiga förändringarna över månader. Således ger denna metod en omfattande analys av mikrokretsarna, vilket möjliggör direkt jämförelse av neurala aktiviteter som framkallas av välkontrollerade stimuli och under ett naturligt beteendeparadigm.
Introduction
Tillkomsten av in vivo tvåfotonfluorescerandeavbildning 1,2, som kombinerar den nya tekniken i optiska system och genetiskt modifierade fluorescensindikatorer, har visat sig vara en kraftfull teknik inom neurovetenskapen för att undersöka den intrikata strukturen, funktionen och plasticiteten i den levande hjärnan 3,4. I synnerhet erbjuder denna avbildningsmodalitet en oöverträffad fördel jämfört med traditionell elektrofysiologi genom att fånga både neuronernas morfologi och dynamiska aktiviteter, vilket underlättar långsiktig spårning av identifierade neuroner 5,6,7,8.
Trots dess anmärkningsvärda styrkor kräver tillämpningen av högupplöst fluorescensavbildning ofta en statisk, huvudfixerad inställning som begränsar djurets rörlighet 9,10,11. Dessutom begränsar användningen av en transparent glasyta för visualisering av neuroner observationer till ett eller flera horisontella plan, vilket begränsar utforskningen av dynamiken i vertikala processer som sträcker sig över olika kortikala djup12.
För att ta itu med dessa begränsningar beskriver den aktuella studien ett innovativt kirurgiskt ingrepp som integrerar fixering av huvudplattan, mikroprisma och miniskop för att skapa en avbildningsmodalitet med flerskikts- och multimodala funktioner. Mikroprismat gör det möjligt att observera den vertikala bearbetningen längs den kortikala kolonnen 13,14,15,16, vilket är avgörande för att förstå hur information bearbetas och omvandlas när den rör sig genom olika lager i cortex och hur den vertikala bearbetningen förändras under plastiska förändringar. Dessutom tillåter det avbildning av samma neurala populationer i ett huvudfixerat paradigm och i en fritt rörlig miljö, som omfattar de mångsidiga experimentella inställningarna 17,18,19: till exempel krävs ofta huvudfixering för välkontrollerade paradigm som sensorisk perceptionsbedömning och stabila inspelningar under 2-fotonparadigmet, medan fri rörelse erbjuder en mer naturlig, flexibel miljö för beteendestudier. Därför är förmågan att göra en direkt jämförelse i båda moden avgörande för att öka vår förståelse av de mikrokretsar som möjliggör flexibla, funktionella svar.
I huvudsak erbjuder integrationen av fixering av huvudplattan, mikroprisma och miniskop i fluorescensavbildning en lovande plattform för att undersöka komplexiteten i hjärnans struktur och funktionalitet. Forskare kan ta prover på identifierade cellpopulationer på olika djup som spänner över alla kortikala lager, direkt jämföra deras svar i både välkontrollerade och naturliga paradigm och övervaka deras långsiktiga förändringar under månader20. Detta tillvägagångssätt ger värdefull insikt i hur dessa neurala populationer interagerar och förändras över tid under olika experimentella förhållanden, vilket ger ett fönster till den dynamiska naturen hos neurala kretsar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment utfördes i enlighet med UK Animals (Scientific Procedures) Act 1986 under personliga licenser och projektlicenser som godkänts och utfärdats av det brittiska inrikesministeriet efter lämplig etisk granskning. Transgena linjer för vuxna CaMKII-TTA; GCaMP6S-TRE21 avlades och deras avkommor användes i experimentet. För experimentatorernas säkerhet och upprätthållandet av sterila förhållanden utfördes alla procedurer under aseptiska förhållanden och med full personlig skyddsutrustning.
1. Preoperativ förberedelse
- För att minimera ödem, administrera dexametason (0,2 mg/kg) subkutant, 12-24 timmar före operationen.
- Sterilisera alla kirurgiska verktyg i en autoklav och sterilisera operationsområdet med stabiliserad hypoklorsyra med destillerat vatten och 70 % etanol före operationen. Se till att all kirurgisk utrustning är påslagen.
- Bedöva djuret (24 veckor gammalt, hane som väger 31 g) med isofluran med en induktionsdos på 5 %, som minskar till 1-2 % när musen är på den stereotaktiska ramen, med O2 mellan 1-2 L/min. Injicera NSAID (karprofen, 2,5 mg/kg) subkutant.
- Kontrollera om det inte finns någon tånypreflex för att bedöma anestesidjupet (öka isoflurankoncentrationen i steg om 0,5 % om reflexen syns).
- Raka djurets huvud med hjälp av en trimmer från bakom öronen till strax ovanför ögonen. Rengör detta område med en spritservett och povidon-jodlösning, se till att undvika kontakt med djurets ögon.
- Montera djuret på den homeoterma värmedynan och den stereotaktiska ramen försedd med öron- och tandstänger och fäst huvudet. Se till att huvudet är stabilt, eftersom detta är avgörande för att följande procedur ska lyckas (Figur 1).
- Applicera ögonsalva över djurets ögon för att förhindra att de torkar ut under operationen och täck dem med folie för att skydda dem från ljus. Täck djuret med ett sterilt kirurgiskt skydd.
Figur 1: Förberedelse före operation. Musen placeras på den stereotaktiska ramen, säkrad med en näsbit och öronstänger. Musen placeras på en temperaturreglerad uppvärmd dyna. Ögonen har en oftalmisk salva och är täckta av aluminiumfolie. Huvudet är rakat och skallen är blottad. Ett sterilt hölje placeras över djuret. Klicka här för att se en större version av denna figur.
2. Kraniotomi
- Använd en kirurgisk sax och snitta huden längs mittlinjen av det rakade området på huvudet för att exponera skallen.
- Rengör skallen med en steril bomullspinne och utspädd väteperoxid (3 % vikt/volym av 35 % H2O2 i 97 % dH2O) i 1-3 s för att avlägsna eventuell bindväv (Figur 2A). Torka skallen med en droppe 70% etanol och en ny steril bomullspinne.
- Rikta in skallen främre/bakre (AP) och medialt/lateralt (ML) för att säkerställa ett korrekt implantationsställe. För att göra detta, mät skallens dorsoventrala (DV) djup vid både bregma och lambda och se till att skillnaden mellan de två är <0,03 mm. För den mediolaterala inriktningen, mät ekvidistant punkter på båda parietalbenen från mittlinjen och se igen till att DV-skillnaden är <0,03 mm.
- Använd bregma som ursprung, hitta och markera det önskade kortikala området; här är dessa monokulär primär synbark (V1), AP: -3,5 mm, ML: -2,5 mm.
- Använd en trefinborr (1.8 mm diameter) och dentalborr (10 000 rpm hastighet) för att exponera cortex, se till att markeringen för det önskade kortikala området (monokulär V1) är placerad inom den nedre tredjedelen av borrkronans fönster.
- Se till att vinkeln på borrkronan är vinkelrät mot skallens krökning. Detta kommer att säkerställa en jämn kraniotomi och förhindra skador på dura eller cortex.
- Borra tills motståndet minskar och stoppa sedan (Figur 2B). Ta försiktigt bort det lossnade benfragmentet med en 23G nålspets (Figur 2C).
- Rengör den exponerade cortex med kirurgiskt skum mättat i kall konstgjord cerebrospinalvätska (ACSF) för att ta bort eventuellt skräp och stoppa eventuell blödning som kan uppstå.
- Håll alltid den exponerade cortexen hydrerad, med kall ACSF, under hela operationen.
Figur 2: Kraniotomi. (A) Hudsnitt mellan bregma och lambda visas. Bindväv har avlägsnats från den exponerade ytan. (B) Kraniotomi genom trefinborr innan benfragmentet avlägsnas. (C) Kraniotomi efter avlägsnande av benfragment, som visar intakt dura och cortex (skalstrecket representerar 0,5 mm). Klicka här för att se en större version av denna figur.
3. Förskuret snitt
OBS: För att beaktas när du utför det förskurna snittet måste snittet och mikroprismaimplantationen vara framför det avbildningsområde av intresse (ROI). Detta för att möjliggöra ett fullständigt och korrekt synfält. I samband med detta protokoll kommer snittet att utföras längs den mediolaterala axeln och mikroprismat är orienterat mot den bakre (Figur 3B).
- För att hjälpa till med insättningen och för att lindra trycket i cortex under införandet av mikroprismat, gör ett snitt.
- Fäst den kirurgiska kniven på den stereotaktiska armhållaren och rikta bladet eller den stereotaktiska armen så att den skär längs ML-axeln.
- Flytta kniven till önskad AP-koordinat (AP: -3.4 mm); prismat måste vara framför ROI, så gör snittet 100 μm framför avbildningens ROI AP-koordinat (-3.5 mm).
- Flytta nu kniven till den mediala kanten av kraniotomin, där den möter skallen, sänk långsamt kniven tills den når benet och stanna sedan. Eftersom bentjockleken är 200 μm, införliva detta värde i det totala införingsdjupet (se steg 5.1 beräkning).
- Optimal avbildning är i mitten av prismat, dvs 500 μm; Se därför till att detta djup är i linje med det kortikala kolonndjupet (ROI DV: - 0,35 mm).
- Om du tar hänsyn till skallens tjocklek i beräkningen av djupet, använd ekvationen nedan, som bestämmer hur djupt det förskurna snittet måste vara från skallens yta. För detta protokoll beräknas implantationsdjupet som:
Bentjocklek (200 μm) + avbildnings-ROI (t.ex. 350 μm) + återstående mikroprismadjup (500 μm) = 1 050 μm
- Om du tar hänsyn till skallens tjocklek i beräkningen av djupet, använd ekvationen nedan, som bestämmer hur djupt det förskurna snittet måste vara från skallens yta. För detta protokoll beräknas implantationsdjupet som:
- Se till att snittets längd är mer än 1 mm men inte överdriven; därför är ett avstånd på 1,2 mm idealiskt, med den monokulära ML-koordinaten i mitten av detta avstånd.
- När du är redo att utföra snittet, ta bort överflödig ACSF så att sikten inte skyms (Figur 3A).
- Flytta kniven från den mediala kanten av kraniotomin till den mediala startkoordinaten för snittet. Sänk långsamt (10 μm/s) kniven ner i cortex.
- När duran är genomborrad och kniven har kommit in i cortex, applicera en droppe kall ACSF på cortex för att hålla vävnaden smord och återfuktad under snittet.
- När det slutliga djupet har uppnåtts, börja flytta kniven längs ML-axeln (med en hastighet av 10 μm/s).
- Fortsätt att observera den omgivande vävnaden när snittet görs. Om vävnaden släpar med kniven, flytta kniven upp och ner några gånger för att säkerställa att vävnaden skärs, och fortsätt sedan i sidled, kom ihåg att sätta tillbaka kniven till sitt slutliga djup.
- När du är klar, höj långsamt kniven. Om blod kommer ut under snittet, använd denna tid för att rengöra snittstället med ACSF-indränkt kirurgiskt skum för att späda ut blodet och trycka ut eventuellt blod i snittet. Kom ihåg att lämna ett färskt, mättat kirurgiskt skum över den exponerade cortex tills du är redo att sätta in mikroprismat.
Figur 3: Implantation av mikroprisma. (A) Snitt före snitt. (B) Schematisk bild av den integrerade mikroprismalinen som visar dess position i cortex (C) Integrerad mikroprismalins i rätt riktning för att förskära snittet innan den förs in i cortex (skalstrecket representerar 0,5 mm). (D) Exempel på cementuppbyggnad runt den integrerade linsen för att säkra dess fastsättning i skallen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
4. Insättning av mikroprisma och implantation av huvudplatta
- Mikroprismalinen består av en gradientindexlins fäst vid ett prisma i linsens distala ände, som är integrerad i en basplatta. Fäst mikroprismat på implantatsatsen.
- Se till att prismats bildsida är motsatt bottenplattans skruv. För att underlätta införandet och placeringen av mikroprismat, fäst det på den stereotaktiska ramen och orientera prismat så att det är i linje med snittet (Figur 3C).
- Sänk långsamt ner mikroprismat i snittstället (10 μm/s). Kom ihåg att ta bort ACSF när du först sätter in prismat, men när du väl är i cortex, spola med kall ACSF för att smörja insättningen.
- Hjärnbarken ska förbli stabil medan prismat sänks ner i snittet; om inte, lägg till extra ACSF och skaka cortex genom att flytta prismat upp och ner för att lossa cortex från prismat.
- När det slutliga djupet har uppnåtts, torka den exponerade kortikala ytan med steril vävnad, var noga med att inte vidröra prismat.
- Täck det exponerade kortikala området som omger prismat, såväl som linsen, med ett skyddande lager av silikonlim, vilket minimerar överflödigt lim på den omgivande skallen och provkikaren.
- När den är härdad (5-10 min), fäst huvudplattan på skallen för att stabilisera huvudet under huvudfixerad avbildning.
- Se till att huvudplattan är tillräckligt bakre för att inte störa placeringen av implantatet och för att möjliggöra adekvat applicering av cement för att säkra implantatet ordentligt.
- Se till att huvudplattans mittlinje ligger något till höger om den implanterade linsen för att säkerställa att båda sidor av huvudplattan kan fästas vid huvudet stage när du utför huvudfixerade experiment
- Applicera självhäftande cement på huvudplattan och skallen.
- Bered adhesiv tandcement genom att blanda 1 skopa ogenomskinligt cementpulver med 4 droppar blandningsmedium och applicera en droppe av katalysatorn.
- Placera cement på både huvudplattan och skallen och håll huvudplattan på plats tills den härdat, se till att den är parallell med öronstängerna (genom visuell undersökning, inspektera både ovanifrån och bakom djurets huvud).
- Applicera självhäftande cement för att täcka resten av den exponerade skallen och vävnaden, med mikroprismat (upp till basen av basplattan) och huvudplattan.
- Få inte cement på bottenplattan, dummymikroskopet eller någon av dess komponenter. Fortsätt att applicera limcementet tills mikroprismat och huvudplattan är täckta och stabila (Figur 3D).
- När cementet har härdat, lossa dummymikroskopet genom att flytta den stereotaktiska armen långsamt uppåt samtidigt som mikroprismat stabiliseras med en pincett (de är anslutna via magneter, därför kan ett visst motstånd under separationen kännas).
- Sätt i skyddskåpan på linsen och dra åt skruven för att säkra den på plats.
- Ta bort djuret från den stereotaktiska ramen, låt det återhämta sig i en varm uppvakningslåda och administrera uppvärmd steril 0,9 % koksaltlösning subkutant (3 % av kroppsvikten).
- När djuret är vaket och rör på sig, placera det tillbaka i en ren bur med ett enda hus. Övervaka djuret och administrera ytterligare smärtlindring efter operationen enligt den lokala institutionens policy för smärtlindring.
- Vänta i 4 veckor efter operationen, djuret ska vara redo för bildbehandling.
5. Enfotonkalciumavbildning av kortikala lager hos fritt rörliga möss
OBS: Det är viktigt att använda bilder som tagits från den ursprungliga bildsessionen varje gång för att säkerställa korrekt insamling av det avsedda bildplanet. Dessa identifierade landmärken, tillsammans med neuronerna, spelar en avgörande roll i anpassningsprocessen som beskrivs i detalj i steg 9 i protokollet. Vid insamling av data från en foton är miniskopet både bildsystemet och laserkällan. Excitation använder LED med ett effektområde på 0-2 mW/mm2 på objektivets främre yta. Lasern använder en excitationsvåglängd på 455 ± 8nm (blått ljus) för GCaMP-signalering. Objektivets fokusreglage kan användas för att justera fokus (Z-axeln), som representeras på gränssnittet som 0-1000, där 0 representerar ett 0 μm arbetsavstånd och 1000 representerar det maximala arbetsavståndet på 300 μm.
- Innan du samlar in data, låt djuret acklimatisera sig till rummet och den öppna arenan i 1 timme före inspelningssessionen.
- Desinficera och rengör allt med lämpliga desinfektionsmedel (t.ex. stabiliserad hypoklorsyra med destillerat vatten och 70 % etanol) före avbildning.
- Ställ in DAQ-boxen genom att ansluta den till en dator och starta datainsamlingsprogramvaran. Upprätta en direktanslutning via en Ethernet-kabel för att minimera tappade ramar; Det trådlösa anslutningsläget kan dock räcka beroende på styrkan på den trådlösa anslutningen.
- Fäst miniskopet på djurets basplatta under en försiktig skrubb.
- Ta först bort skyddskåpan från bottenplattan genom att skruva loss ställskruven. Håll locket i öppningen med en pincett. Fäst sedan miniskopet på basplattan, där locket sitter.
- Kontrollera miniskopets orientering i förhållande till bottenplattan innan du installerar det så att sidan med skruvens markering är vänd mot skruven.
- När miniskopet är monterat, dra åt ställskruven för att stabilisera det. För bara fram ställskruven tills ett visst motstånd kan kännas. Att dra åt ställskruven för hårt skulle potentiellt skada miniskopet och bör därför undvikas.
- Anslut miniskopet till DAQ-boxen och förbered programvaran för inspelning.
- I datainsamlingsprogrammet slår du på strömmen för miniskopet och justerar inspelningsparametrarna (bildhastighet, förstärkning, LED-effekt, efocus-värde) för att uppnå ett tydligt synfält (Figur 4A).
- Slå på histogramfönstret och justera förstärkningen och LED-effekten så att den inspelade intensiteten ligger mellan 35 % och 70 %.
- Om du utför en longitudinell studie, se de inspelningar eller ögonblicksbilder som tagits under en tidigare session och justera efocus-värdet så att samma bildplan syns tydligt.
- Starta experimentet och datainsamlingen.
- När experimentet är klart tar du bort djuret från beteendeapparaten.
- Lossa ställskruven under en försiktig skrynkling och ta bort miniskopet från djurets basplatta.
- Sätt tillbaka skyddskåpan på bottenplattan och stabilisera den med ställskruven.
- Sätt tillbaka djuret i sin hembur (fortsätt till steg 7 om du vill bearbeta data med en foton).
Figur 4: Datainsamling och databehandling med programvara. (A) En bild som visar realtidsströmmen från miniskopet. Det rekommenderas att justera objektivets fokusvärde, så att en tydlig view ses i strömningsfönstret, tillsammans med förstärkningen och bildlasereffekten (B) Schematisk graf som illustrerar det rekommenderade justeringsarbetsflödet för sessioner inspelade vid olika tidpunkter. Vi rekommenderar att du genererar en medelbild från den första sessionen genom att följa instruktionerna för databehandlingsprogrammet. Den här bilden ska användas som referensbild under rörelsekorrigering för följande sessioner. (C) Exempel på fyra celler från samma maxprojicerade ΔF/F-bild. En orange linje ritas över varje cell för att mäta dess celldiameter i pixlar, vars medelvärde används som ett indataargument för cellidentifieringsalgoritmen (överst till vänster: 13, överst till höger: 11, nederst till vänster: 12, nederst till höger: 13). (D) Utdata från cellidentifieringsalgoritmen efter manuell kurering (bilden beskuren). Vita konturer representerar de identifierade cellerna (skalstapeln representerar 100 μm). Klicka här för att se en större version av denna figur.
6. Tvåfotonkalciumavbildning av kortikala lager hos huvudfixerade möss
OBS: För laserskanningsmikroskopi med två fotoner är ljuskällan en avstämbar ultrasnabb laser med en excitationsvåglängd på 920 nm. Excitationseffekten, uppmätt vid objektivet, var vanligtvis mellan 100-150 mW och justerades i varje session för att uppnå liknande nivåer av fluorescens. Emissionsljuset filtrerades av ett emissionsfilter (525/70 nm) och mättes av ett oberoende fotomultiplikatorrör (PMT), en så kallad grön kanal. Bilderna togs med ett 20x luftnedsänkningsobjektiv (NA = 0,45, 6,9-8,2 mm arbetsavstånd).
- Innan du samlar in data ska du vänja djuret vid apparaten dagarna innan (för att få djuret att bli bekvämt med beteendeinställningen). Låt djuret tillbringa 15-30 minuter om dagen, i 2-3 dagar, med att utforska installationen eller tills de visar naturligt beteende innan de påbörjar datainsamlingen.
- Slå på bildsystemet med två fotoner, starta insamlingsprogramvaran och slå PÅ lasern. Se till att lasrarna är slutna och att PMT:erna är avstängda innan du fortsätter.
- Rengör tvåfotonavbildningsapparaten med stabiliserad hypoklorsyra med destillerat vatten och 70 % etanol.
- Se till att justera apparaten så att den passar djurets storlek. Fäst försiktigt musen och dess huvudplatta på head-stage inställning och skruva fast den för att stabilisera mushuvudet.
- När det är monterat, ta bort linsskyddet (se steg 5.4.1) och rikta in objektivet så att det är över bottenplattan.
- Använd epifluorescens- och XYZ-scenkontrollerna för att få kortikal vävnad i fokus.
- När de kortikala lagren är synliga, byt mikroskopet för att tillåta tvåfotonavbildning (byt ut spegeln mot den dikroiska spegeln, stäng den fluorescerande slutaren och stäng av epifluorescenslasern och monitorn). Se till att stänga AV huvudlamporna för att skydda PMT:erna vid avbildning.
- Ställ in parametrar för att optimera hämtade bildfiler.
- Använd resonansinsamlingsläge för kalciumavbildning eftersom det kan fånga den snabba avfyrningen av GCaMP-signaler.
- Justera lasereffekt, PMT-förstärkning, zoom och uppslagstabeller (LUT) för att få en optimal bild och hänvisa till enfotonbilden för att säkerställa att rätt fokalplan avbildas.
- Börja avbilda kortikala lager med tvåfotonsystemet med synkroniserad beteendeövervakning och stimulusingångar (om tillämpligt).
- Se till att spara dessa insamlingsparametrar och XYZ-avstånd om du vill reproducera identiska bilder över tid.
- För att fånga en z-stack av de kortikala lagren, följ stegen som beskrivs nedan.
- Hitta planet att starta z-stacken från, justera insamlingsparametrarna för att optimera bilden och markera detta som startpunkt i programvaran.
- Använd sedan Z-kontrollen, flytta nedåt i stacken, justera bara lasereffekten för att bibehålla en konstant luminans hos stacken och markera slutet av stacken på programvaran.
- Kritiskt steg: med hjälp av alternativet Relativ exponentiell gradient under fliken Laser Power Gradient kan du låta programvaran beräkna ökningen av lasereffekten när den rör sig genom z-stacken. Var noga med att markera slutpunktslasereffektvärdena i tabellen som tillhandahålls av programvaran så att den kan beräkna gradienten.
- När z-stackparametrarna har ställts in justerar du stegstorleken (μm).
OBS: Stegstorleken avgör hur lång tid det tar, antal skivor och detaljkvaliteten på stapeln. Mindre stegstorlekar kommer att resultera i längre förvärvstid, en ökning av antalet skivor och bättre detaljer jämfört med större stegstorlek. Z-stackar används för att hjälpa till med registreringen av bilder med en foton och två fotoner, eftersom de kommer att markera alla anatomiska landmärken eller funktioner.
- För att få en tidsserie (T-serien) av kalciumförändringar i neuroner, hitta ett optimalt fokalplan med hjälp av XYZ-stegkontrollerna och justera lasereffekten, PMT-förstärkningen, zoomen och LUT.
- Under fliken T-serien i insamlingsprogramvaran definierar du insamlingsfrekvensparametrar för att matcha data som förvärvats med hjälp av enfotonavbildningssystemet.
OBS: Matchning av frekvensen kommer att göra 1P- och 2P-data jämförbara, och den är bättre lämpad för cellidentifieringsalgoritmen som används i databehandlingsstegen. Flera triggers och andra exponeringslägen kan integreras i T-seriens förvärv.
- Under fliken T-serien i insamlingsprogramvaran definierar du insamlingsfrekvensparametrar för att matcha data som förvärvats med hjälp av enfotonavbildningssystemet.
- Påbörja anskaffning av T-serien.
7. Bearbetning av kalciumavbildningsdata med en foton
- För inspelning av filmer med en foton, använd databehandlingsprogrammet som medföljer miniskopsystemet.
- Förbearbeta först filmen genom rumslig och tidsmässig nedsampling. I allmänhet skulle rumslig nedsampling av filmen med en faktor två avsevärt minska bearbetningstiden utan att allvarligt äventyra cellidentifieringsnoggrannheten.
- Ställ in tidsmässig nedsamplingsfaktor så att filmens bildfrekvens sänks till cirka 10 Hz, vilket är mer lämpligt för cellidentifieringsalgoritmen som används i följande steg.
- Om du hämtar flera filmer på samma bilddag kombinerar du filmerna i en tidsserie före förbearbetningssteget för att bearbeta dem tillsammans.
- Valfritt: Använd ett spatialt bandpassfilter på filmen för att ta bort de lägre och högre rumsliga frekvenserna, vilket ger en jämnare film med högre kontrast.
- Registrera filmen med hjälp av programvarans rörelsekorrigeringsfunktion. Detta registrerar filmen och korrigerar för rörelseartefakter som orsakas av miniskopets rörelse i förhållande till bildytan.
- Kritiskt steg: Om du utför en longitudinell studie, registrera filmerna i samma synfält, t.ex.ample, medelbilden av filmen tagen på den första bilddagen (Figur 4B).
- Beräkna ΔF/F för filmen med hjälp av motsvarande flik och projicera filmen för att generera en maximal projektionsbild av ΔF/F-filmen. Den här bilden kommer att visa regioner som visar förändringar i fluorescensnivåer, potentiellt enskilda neuroner, och kan användas för att mäta den genomsnittliga diametern på neuronerna (Figur 4C).
- Alternativt kan du mäta celldiametern på den rörelsekorrigerade filmen, där neuronerna visar tydlig fluorescens.
- Identifiera celler med hjälp av algoritmerna i programvaran.
- Även om två alternativ (PCA-ICA och CNMF-E) är tillgängliga i detta steg, använd CNMF-E för denna studie. Mata in den genomsnittliga celldiametern i pixlar och kör algoritmen för att generera en celluppsättning som innehåller intresseområden (ROI) som visar cellliknande aktiviteter.
- Välj manuellt ROI:er som är celler (har en cellliknande morfologi och aktivitet22,23 och ligger inom synfältet) från de som inte är det, och validera den kuraterade celluppsättningen (figur 4D).
- Exportera kalciumspåren för varje ROI för vidare analys.
8. Bearbetning av kalciumavbildningsdata med två foton
- För inspelning av filmer med två foton använder du ett python-paket som är utformat för att bearbeta kalciumanalysdata med två fotoner.
- Kombinera först bilderna som tagits i en T-serie till en .tiff stapel enligt beskrivningen nedan.
- Under gränssnittet Kör alternativ, justera parametrarna, inklusive tau-värdet och bildhastigheten, så att de matchar GCaMP som används och bildfrekvensen för inspelningen.
- Valfritt: Ställ in parametern do_registration på 1 för att registrera filmen. Detta motsvarar rörelsekorrigeringssteget som beskrivs ovan.
- Valfritt: Ställ in parametern anatomical_only till 1 för att detektera ROI med hjälp av de anatomiska funktionerna utöver fluorescensdynamiken. Detta kräver inmatning av celldiameter, så gör mätningar med hjälp av bildbehandlingsprogrammet. Detta rekommenderas i allmänhet eftersom det genererar ROI med mer naturliga former (Figur 5A-C).
- När alla parametrar har angetts kör du algoritmen så att den utför alla beräkningar tillsammans. Se det grafiska användargränssnittet (GUI) för att kontrollera förloppet.
- När det är klart, gå tillbaka till cellvalsgränssnittet för manuell kurering av cellidentifieringsresultaten.
- Spara en bild av den utvalda celluppsättningen ovanpå den maximala projektionen av filmen. Detta kommer senare att användas som referensbild för registrering av enfotoninspelningsdata.
- Algoritmen sparar sedan resultaten automatiskt. npy-format, som kan nås senare med Python. Du kan också spara resultaten i andra formaterade filer för vidare analys i annan programvara.
Figur 5: Cellidentifiering med hjälp av programvara för bearbetning av två fotoner. A) Representativ bild av cellidentifiering som tagits med hjälp av programvaran för behandling av två fotoner. Om du ställer in Anatomical_only parameter till 0 men behåller alla andra parametrar samma, finns flera icke-celler i området mellan streckade linjer som stör den manuella kureringen av faktiska celler. (B) Exempel på celldiametermätningar tagna från (A) med hjälp av ett bildbehandlingsprogram (överst till vänster; 7,5 pixlar, överst till höger; 9, nederst till vänster; 6,5, nederst till höger; 7,5). C) Representativ bild av cellidentifiering. När du ställer in Anatomical_only parameter till 1 och matar in den genomsnittliga celldiametern som tas från (B) i celldiameteralgoritmen, finns inga celler i området mellan streckade linjer (skalstaplar representerar 200 μm). Klicka här för att se en större version av denna figur.
9. Registrering av identifierade celluppsättningar i olika avbildningsmodaliteter
- Utför registrering av celler identifierade från enfoton- och tvåfotoninspelningar med den multimodala bildregistrerings- och analysalgoritmen (MIRA), som är tillgänglig via Python-gränssnittet för enfotonavbildningsprogramvaran.
- Denna algoritm justerar data med en foton och två foton via icke-stel registrering. Se den uppsättning anteckningsböcker för demonstrationer online som finns på webbplatsen och som används för denna studie.
OBS: Anteckningsböckerna skrevs så att all bearbetning skulle slutföras i 1P-programvaran och är därför inte kompatibla med 2P-bearbetningsprogramvaran. Följ därför bara några av stegen i anteckningsböckerna för den här studien.
- Denna algoritm justerar data med en foton och två foton via icke-stel registrering. Se den uppsättning anteckningsböcker för demonstrationer online som finns på webbplatsen och som används för denna studie.
- Följ stegen som beskrivs i demonstrationsanteckningsböckerna, som omfattar att generera en strukturell bild för varje avbildningsmodalitet. Som standard innebär detta att generera en maximal projektion av z-stacken med två foton och en medelbild av inspelningen med en foton. Alternativt kan du använda en medelbild av inspelningen med två fotoner.
- När du uppmanas till det filtrerar rumsliga bandpass bilderna för att bättre visualisera landmärkena och omorientera dem så att de matchar.
- Välj matchande landmärken på de två bilderna (Figur 6A).
- Använd dessa för att beräkna den tänjning som behövs för att justera de två bilderna. I allmänhet bör 3 till 5 landmärken vara tillräckligt.
- Algoritmen beräknar tänjningen baserat på en kombination av landmärken och bildlikhet. Optimera för den relativa vikt som ges till de två faktorerna tills tillfredsställande resultat uppnås.
- Tänj cellkartan som hämtats i en enfotonsession för att generera en ny cellkarta som är justerad mot tvåfotondata.
- Importera sedan denna förvrängda cellkarta till 1P-bearbetningsprogrammet för att generera en bild med den maximala projektionsbilden från tvåfotonfilmen i bakgrunden.
- Exportera den här avbildningen i registreringssyfte.
- I programmeringsprogramvara, justera de två bilderna som genererats hittills (tvåfotoncellskarta ovanpå tvåfotonmaximal projektionsbild) och förvräng enfotoncellkarta ovanpå tvåfotonmaximal projektionsbild (figur 6B,C).
- För att göra detta, för denna studie, använd en registreringsuppskattningsapplikation som gör det möjligt för användaren att jämföra resultaten av olika registreringstekniker. Med tanke på att de två bilderna har samma bakgrund var faskorrelationstekniken, med stel registrering, tillräcklig.
- När registreringen är klar skannar du den nu registrerade avbildningen efter överlappande ROI:er. Det här är ROI:er som är aktiva i båda inspelningssessionerna, som kan användas i ytterligare analys.
Figur 6: Cellregistrering över flera modaliteter med hjälp av MIRA-arbetsflödet. (A) Representativ bild från arbetsflödet för celljustering. Medelbilden från enfotondata visas till vänster och den från tvåfotondata visas till höger. Matchande landmärken från båda bilderna väljs och märks i programvaran med ett slumpmässigt färgschema (röda cirklar). (B) Exempeljusterade bilder som visar de två identifierade celluppsättningarna, en foton (lila) och två foton (grön), läggs över på medelbilden av data med två fotoner. (C) Bild av området markerat med den vita rutan i (B), justerade celler representeras här som överlappande gröna och lila konturer. I alla paneler representerar skalstapeln 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Metoden att utföra kronisk flerskiktad in vivo kalciumavbildning av samma neuronala population under en period av flera veckor, med hjälp av både en- och tvåfotonavbildningsmodaliteter, under fritt rörliga och huvudfixerade förhållanden har visats. Här har förmågan att identifiera matchande neuronala populationer under enfotonavbildning medan djuret utforskade en öppen arena i mörker demonstrerats (Figur 7A). Kalciumspår extraherades från de identifierade neuronerna och z-poängades för jämförelse (Figur 7B). Neuroner visade jämförbara nivåer av fluorescens och avfyrningshastigheter i sessioner med 3 veckors mellanrum.
Figur 7: Kalciumdynamik från den primära synbarken kan registreras stabilt över sessioner som sträcker sig över 3 veckor. (A) Rumsliga filter av identifierade neuroner överlagrade på de maximala projektionsbilderna från tre separata inspelningar av samma synfält under en fotonfritt rörlig kalciumavbildning, som sträcker sig över en varaktighet av 3 veckor. ROI:er märks i den ordning de presenteras i (B). Mörka områden i den andra (mitten) och tredje (högra) sessionen är resultatet av bildregistreringen, med den första (vänstra) sessionen som referens (skalstrecket representerar 0,5 mm). (B) Z-skattade kalciumaktiviteter för de registrerade ROI:erna i den första (vänster), andra (mitten) och tredje (högra) sessionen som visas i (A). Den horisontella skalstapeln är 10 s och den vertikala skalstapeln är 10 sd. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Därefter demonstrerades registreringen av en neuronal population över olika avbildningsmodaliteter. Avbildningssessioner med en och två foton genomfördes samma dag. ROI identifierades från data med en foton och kurerades manuellt för att generera en cellkarta (figur 8A). På samma sätt bearbetades data med två fotoner för att generera en cellkarta där celler automatiskt identifieras och väljs ut manuellt för demonstration. Sedan justerades den genomsnittliga projektionsbilden från enfotonsessionen till den maximala projektionsbilden från z-stacken med två foton med MIRA-plattformen (figur 8B). Denna förvrängda cellkarta exporterades sedan, överlagrades på den maximala projektionsbilden med två foton och justerades med cellkartan med två foton (figur 8C). Detta möjliggjorde cellidentifiering som visade aktiviteter hos samma celler under båda avbildningsmodaliteterna (Figur 8D), vilket kan användas för kvantitativ analys av neuronala svar.
Figur 8: Kalciumdynamik från den primära synbarken registrerad mellan olika avbildningsmodaliteter. (A) Rumsliga filter av identifierade neuroner överlagrade på den maximala projektionsbilden från en enfoton, fritt rörlig session. Märkta neuroner är de som framgångsrikt registrerades till tvåfotoninspelningsdata som presenteras i (C). (B) Samma konturer som visas i (A) förvrängdes för att matcha de data för två fotonsessioner som visas i (C). (C) Rumsliga filter av ROI som visas i (A) efter justering (vit) och ROI identifierade med hjälp av 2P-bearbetningsprogramvaran från en huvudfixerad inspelningssession med två foton samma dag (grön), överlagrad på den maximala projektionsbilden från tvåfotonsessionen. Överlappande ROI anses vara registrerade och väljs ut för vidare analys (skalstaplar representerar 0,5 mm). (D) Z-poängad kalciumaktivitet för de registrerade ROI:erna i enfotoner (vänster) och tvåfotoner (höger) (horisontell skalstapel är 10 s och vertikal skalstapel är 10 sd). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här har vi visat förmågan att observera och direkt jämföra nervceller i huvudfixerade och fritt rörliga förhållanden i samma neurala populationer. Medan vi demonstrerade tillämpningen i den visuella cortex, kan detta protokoll anpassas till en mängd andra hjärnområden, både kortikala områden och djupa kärnor 24,25,26,27,28, såväl som andra datainsamlings- och beteendeinställningar 29,30.
Det är viktigt att notera de kritiska stegen i detta protokoll eftersom de möjliggör optimal datainsamling. För det första, när man utför z-stackar är det viktigt att upprätthålla konsekvent luminans hela tiden. Som beskrivits tidigare kommer ljus att spridas ju mer vävnad det måste tränga igenom; Således, genom att öka förstärkningen, har lasern mer kraft för att kunna penetrera vävnaden ytterligare och excitera våra ROI. Det rekommenderas dock inte att starta z-stacken vid den förstärkning som krävs för att excitera ROI i den djupa vävnaden, eftersom detta kommer att orsaka överexponering av fluorescerande strukturer och fototoxicitet och kan bleka vävnaden på ytan av cortex. Om du väljer alternativet Relativ exponentiell gradient kan programvaran därför beräkna en stadig gradient av effekt som behövs för att kunna vara optimal vid varje steg i z-stacken. För det andra är nästa kritiska steg för att hjälpa till med konsekvent registrering av celluppsättningar över tid att se till att spara medelbilden av filmen som togs vid den första enfotonavbildningssessionen. Detta gör det möjligt för användaren att jämföra eventuella efterföljande bildsessioner med originalbilden för att säkerställa kontinuitet i celluppsättningar och datainsamling.
Det är värt att notera att lätta miniatyriserade tvåfotonmikroskop har utformats oberoende31,32, vilket möjliggör högupplöst avbildning i djur som beter sig fritt. Även om det belyser ett spännande framsteg för högupplöst in vivo-avbildning, gör det begränsade synfältet (FOV) och den mycket specialiserade designen det utmanande för allmänna slutanvändare. Metoden vi beskrev integrerar flera väletablerade plattformar som är lättillgängliga från kommersiella leverantörer, vilket gör den till ett tillgängligt val. I teorin kan den också ersättas med ett skräddarsytt, självmonterat mikroprisma som är kompatibelt med ett miniskop med öppen källkod och ett generiskt tvåfotonmikroskop 33,34.
Icke desto mindre står detta protokoll inför utmaningar som exakt implantation av mikroprisma eftersom fel kan leda till icke-livskraftiga FOV och följaktligen komprometterade data. Att upprätthålla konsekventa synfält över olika modaliteter är också en utmaning på grund av de olika mål som används för bildinsamling. Men eftersom XY-axlarna i mikroprismat förblir fixerade, är variationen i FOV längs Z-axeln; därför används specifika landmärken som finns i båda avbildningslägena (såsom blodkärl, artefakter i kortikal vävnad och identiska neuroner) för att synkronisera FOV. Dessutom är det viktigt att tillämpa registrering för att anpassa och identifiera samma neuroner under olika modaliteter. En annan utmaning att vara medveten om är att minimera fotoblekning av GCaMP-vävnaden under insamlingen i båda modaliteterna. Därför är det viktigt att minska den tid som går åt till inspelning, optimera signal-brusförhållandet (genom att öka förstärkningen snarare än LED-/lasereffekten) och vänta 24-48 timmar mellan bildsessionerna.
Trots denna inneboende komplexitet ger vårt protokoll, när det utförs med kirurgisk precision och lämpliga bildbehandlingstekniker, en robust plattform för att jämföra neurala aktiviteter. Det gör det möjligt att jämföra huvudfixerade tillstånd i strikt kontrollerade uppgifter och fritt rörliga tillstånd som efterliknar mer naturliga beteenden, vilket utökar de potentiella tillämpningarna inom neurovetenskapen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna redovisar inga konkurrerande ekonomiska intressen eller intressekonflikter.
Acknowledgments
Vi tackar Charu Reddy och professor Matteo Carandini (Cortex Lab) för deras råd om kirurgiska protokoll och delning av transgen musstam. Vi tackar Dr Norbert Hogrefe (Inscopix) för hans vägledning och hjälp genom utvecklingen av operationen. Vi tackar Andreea Aldea (Sun Lab) för hennes hjälp med den kirurgiska installationen och databehandlingen. Detta arbete stöddes av Moorfields Eye Charity.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium Chloride solution for infusion (Vetivex 11) 250ml | Dechra | 20091607 | Saline for hydration and drug reconsitution |
| 18004-1 Trephine 1.8mm diameter bur | FST | 18004-18 | Drill bit |
| 1ml syringe | Terumo | MDSS01SE | 1ml syringe |
| 23G x 5/8 inch 6% LUER needle | Terumo | NN-2316R | 23G needle |
| 71000 Automated stereotaxic apparatus w/ built-in software | RWD | - | RWD |
| Absorbable Haemostatic Gelatin Sponge (10x10x10mm) | Surgispon | SSP-101010 | gel-foam |
| Alcohol pads 70% isopropyl alcohol | Braun | 9160612 | Alcohol pads |
| Aluminium foil | Any retailer | - | Foil to cover eyes during surgery |
| Articifical Cerebrospinal Fluid | Tocris Bioscience a Bio-Techne Brand | 3525/25ML | ACSF |
| Automated microinjection pump | WPI | 8091 | |
| Betadine solution (10% iodinated Povidone) 500ml | Videne/Ecolab | 3030440 | Betadine |
| Bruker Ultime 2Pplus (customised) | Bruker | - | Two-photon imaging system |
| Cardiff Aldasorber | Vet-Tech | AN006 | Anaesthesia absorber |
| CFI S Plan Fluor ELWD ADM 20XC | Nikon | MRH48230 | 20x objective lens |
| Compact Anaesthesia system - single gas - isoflurane K/F, with oxygen concentrator model: ZY-5AC and scavenging unit | Vet-Tech | AN001 | Compact anaesthesia system |
| Contec Prochlor | Aston Pharma | AP2111L1 | Disinfectant (hypochlorous acid) |
| Dexamethasone Sodium Phosphate Injection, USP, 4mg/ml, NDC: 0641-6145-25 | Hikma | Covetrus:70789 | Dexamethasone |
| Dissecting Knife, cutting edge 4mm, thickness 0.5mm, stainless steel | Fine Science Tools | 10055-12 | Knife for incisino of cortex |
| Dual-Sided, Non-Puncture Mouse & Neonatal Rat Ear Bars | Stoelting | 51649 | Ear bar |
| Dummy microscope | Inscopix | Dummy microscope | To help with implantation |
| Ethanol (100%) | VWR | 40-1712-25 | Used to make 70% ethanol |
| Fisherbrand Nitrile Indigo Disposable Gloves PPE Cat III | FischerScientific | 17182182 | Gloves |
| Homeothermic Monitor 50-7222-F | Harvard Apparatus | 50-7222-F | Homeothermic monitoring system/heating pad |
| Image processing software | ImageJ | - | Image processing software |
| Inscopix Data Processing Software (IDPS) | Inscopix | - | One-photon calcium imaging processing software |
| Insight Duals-232, S/N 2043 | InSight | Insight Spectra X3 | Two-photon imaging laser |
| IsoFlo 250ml 100% w/w inhalation | Zoetis | WM 42058/4195 | Isoflurane |
| Kwik-Sil Low Toxicity Silicone Adhesive | World Precision Intruments (WPI) | KWIK-SIL | Silicone adhesive |
| MICROMOT mains adapter NG 2/S, w/ Drill unit 60/E | PROXXON | NO 28 515 | Handheld drill |
| nVoke Integrated Imaging and Optogenetics System package | Inscopix | - | One-photon Imaging system and software |
| ProView Implant Kit | Inscopix | ProView Implant Kit | Dummy microscope, stereotaxic arm and attachment |
| ProView Prism Probe | Inscopix | 1050-002203 | Microprism lens |
| Rimadyl (50mg/ml) | Zoetis | VM 42058/4123 | Carprofen |
| Stereotaxis Microscope on Articulated arm with table clamp | WPI | PZMTIII-AAC | Microscope |
| Super-Bond Universal kit, SUN Medical | Prestige-Dental | K058E | Adhesive cement |
| Two-photon calcium image software | Suite2P | - | Two-photon calcium imaging processing software |
| Vapouriser | Vet-Tech | - | Isoflurane vapouriser |
| Xailin Lubricating Eye Ointment 5g | Xailin-Night | MLG/28/1551 | Ophthalmic ointment |
References
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50 (6), 823-839 (2006).
- Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
- Vaziri, A., Emiliani, V.
- Holtmaat, A., et al. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Sun, Y. J., Sebastian Espinosa, J., Hoseini, M. S., Stryker, M. P. Experience-dependent structural plasticity at pre- and postsynaptic sites of layer 2/3 cells in developing visual cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (43), 21812-21820 (2019).
- Andermann, M. L., Kerlin, A. M., Reid, R. C. Chronic cellular imaging of mouse visual cortex during operant behavior and passive viewing. Front Cell Neurosci. 4, 3 (2010).
- Sofroniew, N. J., Flickinger, D., King, J., Svoboda, K. A large field of view two-photon mesoscope with subcellular resolution for in vivo imaging. Elife. 5, 14472 (2016).
- Puścian, A., Benisty, H., Higley, M. J. NMDAR-dependent emergence of behavioral representation in primary visual cortex. Cell Rep. 32 (4), 107970 (2020).
- Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo. imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).
- Seaton, G., et al. Dual-component structural plasticity mediated by αCaMKII autophosphorylation on basal dendrites of cortical layer 2/3 neurones. J Neurosci. 40 (11), 2228-2245 (2020).
- Helmchen, F., Denk, W.
- Andermann, M. L., et al. Chronic cellular imaging of entire cortical columns in awake mice using microprisms. Neuron. 80 (4), 900-913 (2013).
- Chia, T. H., Levene, M. J. Microprisms for in vivo multilayer cortical imaging. J Neurophysiol. 102 (2), 1310-1314 (2009).
- Low, R. J., Gu, Y., Tank, D. W. Cellular resolution optical access to brain regions in fissures: Imaging medial prefrontal cortex and grid cells in entorhinal cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (52), 18739-18744 (2014).
- Buxhoeveden, D. P., Casanova, M. F.
- Chen, S., et al. Miniature fluorescence microscopy for imaging brain activity in freely-behaving animals. Neurosci Bull. 36 (10), 1182-1190 (2020).
- Gulati, S., Cao, V. Y., Otte, S. Multi-layer cortical Ca2+ imaging in freely moving mice with prism probes and miniaturized fluorescence microscopy. J Vis Exp. (124), e55579 (2017).
- Resendez, S. L., et al. Visualization of cortical, subcortical, and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses. Nat Protoc. 11 (3), 566-597 (2016).
- Guo, Z. V., et al. Procedures for behavioral experiments in head-fixed mice. PLoS One. 9 (2), 88678 (2014).
- Wekselblatt, J. B., Flister, E. D., Piscopo, D. M., Niell, C. M. Large-scale imaging of cortical dynamics during sensory perception and behavior. J Neurophysiol. 115 (6), 2852-2866 (2016).
- Pnevmatikakis, E. A., et al. Simultaneous denoising, deconvolution, and demixing of calcium imaging data. Neuron. 89 (2), 285-299 (2016).
- Zhou, P., et al. Efficient and accurate extraction of in vivo calcium signals from microendoscopic video data. Elife. 7, 28728 (2018).
- Beckmann, L., et al. Longitudinal deep-brain imaging in mouse using visible-light optical coherence tomography through chronic microprism cranial window. Biomed Opt Express. 10 (10), 5235-5250 (2019).
- Wenzel, M., Hamm, J. P., Peterka, D. S., Yuste, R. Reliable and elastic propagation of cortical seizures in. Cell Rep. 19 (13), 2681-2693 (2017).
- Heys, J. G., Rangarajan, K. V., Dombeck, D. A. The functional micro-organization of grid cells revealed by cellular-resolution imaging. Neuron. 84 (5), 1079-1090 (2014).
- Barson, D., Hamodi, A. S. Simultaneous mesoscopic and two-photon imaging of neuronal activity in cortical circuits. Nat Methods. 17 (1), 107-113 (2020).
- Paquelet, G. E., et al. Single-cell activity and network properties of dorsal raphe nucleus serotonin neurons during emotionally salient behaviors. Neuron. 110 (16), 2664-2679 (2022).
- Yang, Q., et al. Transparent microelectrode arrays integrated with microprisms for electrophysiology and simultaneous two-photon imaging across cortical layers. bioRxiv. , (2022).
- Priestley, J. B., Bowler, J. C., Rolotti, S. V., Fusi, S., Losonczy, A. Signatures of rapid plasticity in hippocampal CA1 representations during novel experiences. Neuron. 110 (12), 1978-1992 (2022).
- Zong, W., et al. Miniature two-photon microscopy for enlarged field-of-view, multi-plane and long-term brain imaging. Nat Methods. 18 (1), 46-49 (2021).
- Engelbrecht, C. J., et al. Ultra-compact fiber-optic two-photon microscope for functional fluorescence imaging in vivo. Opt Express. 16 (8), 5556-5564 (2008).
- Suzuki, M., Aru, J., Larkum, M. E. Double-μ Periscope, a tool for multilayer optical recordings, optogenetic stimulations or both. Elife. 10, 72894 (2021).
- Stibůrek, M., et al. 110 μm thin endo-microscope for deep-brain in vivo observations of neuronal connectivity, activity and blood flow dynamics. Nat Commun. 14 (1), 1897 (2023).
