Summary
캄필로박터는 전 세계적으로 세균성 식인성 위장염의 주요 원인입니다. 시설에서 시설 전체의 유병률을 줄이기 위한 조치를 취하고 있음에도 불구하고 오염된 제품은 지속적으로 소비자에게 도달합니다. 지난 12년 동안 개발된 이 기술은 날고기에서 캄필로박터 종(Campylobacter spp.)을 분리하고 검출하는 기존 방법의 한계를 해결합니다.
Abstract
이 논문은 날고기에서 캄필로박터 종(Campylobacter spp.)을 분리하기 위한 신속하면서도 강력한 프로토콜을 제시하며, 특히 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni )와 캄필로박터 대장균(Campylobacter coli)에 초점을 맞춥니다. 이 프로토콜은 확립된 방법을 기반으로 하며, 미국의 FDA(Food and Drug Administration) 및 미국 농무부(USDA)와 유럽의 ISO(International Organization for Standardization)와 같은 규제 기관에서 사용하는 일반적인 기술과의 호환성을 보장합니다. 이 프로토콜의 핵심은 말의 피를 함유한 볼튼 브로스 배지에 농축 및 재현탁되는 린세이트를 수집하는 것입니다. 이 배지는 스트레스를 받는 캄필로박터 세포의 회복을 촉진하고 필요한 농축 기간을 50% 줄이는 것으로 입증되었습니다. 그런 다음 농축된 샘플은 브루셀라 플레이트의 니트로셀룰로오스 막으로 옮겨집니다. 이 방법의 감도와 특이성을 개선하기 위해 0.45μm 및 0.65μm 공극 크기의 필터 멤브레인을 평가했습니다. 데이터에 따르면 특이성에 영향을 주지 않고 0.45μm 기공 크기에 비해 0.65μm 기공 크기 필터를 사용한 경우 세포 회수율이 29배 증가한 것으로 나타났습니다. 캄필로박터 의 높은 운동성 특성으로 인해 세포가 멤브레인 필터를 통해 한천 배지를 향해 활발하게 이동할 수 있으며, 이를 통해 순수한 캄필로박터 콜로니를 효과적으로 분리할 수 있습니다. 이 프로토콜은 종 수준에서 분리체를 식별하기 위해 다중 정량적 실시간 중합효소 연쇄 반응(mqPCR) 분석을 통합합니다. 이 분자 기술은 신뢰할 수 있고 효율적인 종 식별 수단을 제공합니다. 지난 12년 동안 소매 육류와 관련하여 수행된 조사는 이 방법이 현재의 참조 방법과 비교하여 자연적으로 오염된 육류 샘플에서 캄필로박터 의 회수율을 높일 수 있는 능력을 입증했습니다. 또한 이 프로토콜은 준비 및 처리 시간 단축을 자랑합니다. 결과적으로, 육류에서 캄필로박터를 효율적으로 회수할 수 있는 유망한 대안을 제시합니다. 또한 이 절차는 DNA 기반 방법과 원활하게 통합될 수 있어 포괄적인 전체 게놈 염기서열 분석과 함께 양성 샘플의 신속한 스크리닝을 용이하게 합니다.
Introduction
캄필로박터 종(Campylobacter spp.)은 전 세계적으로 세균성 식인성 위장염의 주요 원인으로, 매년 약 8억 명의 환자가 발생하는 것으로 추정됩니다1. 주요 인수공통감염병인 캄필로박터는 야생조류, 농장동물, 애완동물 등 다양한 동물의 위장관에 자연적으로 서식한다2. 도축 또는 식품 가공 과정에서 캄필로박터 종은 종종 사체나 육류 제품을 오염시킵니다3. 캄필로박터증은 일반적으로 덜 익힌 가금류의 섭취 또는 생가금류즙에 의한 다른 식품의 교차 오염과 관련이 있다2. 길랭-바레 증후군(Guillain-Barré syndrome), 반응성 관절염(reactive arthris), 패혈증(septicemia)과 같은 심각한 합병증을 유발할 수 있다4. 식품 공급원, 특히 가금류 제품에서 캄필로박터를 검출하고 분리하는 것은 공중 보건 감시, 발병 조사 및 위험 평가에 필수적입니다.
종래의 배양 기반 분석법은 캄필로박터 검출을 위한 전통적이고 표준적인 방법이다 5,6. 그러나 긴 배양 시간(48시간 이상), 낮은 민감도(최대 50%), 모든 균주에 국한되지 않는 등 몇 가지 제한 사항이 있습니다(일부 스트레스를 받는 캄필로박터 세포는 배지에서 잘 자라지 않거나 전혀 자라지 않을 수 있음)7. 중합효소연쇄반응(PCR)과 같은 분자 분석법은 배양 기반 방법보다 더 빠르고 민감하지만 추가 특성 분석을 위한 실행 가능한 분리물을 제공하지 않습니다 8,9.
면역학적 방법은 캄필로박터 검출을 위한 대체 및 보완 방법입니다. 이는 빠르고 간단하며 다재다능하지만 교차 반응(일부 항체는 비캄필로박터 박테리아 또는 유사한 항원을 공유하는 기타 물질에 결합할 수 있음), 낮은 특이성(일부 항체는 모든 캄필로박터 균주 또는 혈청형에 결합하지 않을 수 있음) 및 검체 전처리 요구 사항(면역학적 방법은 항체의 결합을 향상시키기 위해 간섭 물질을 제거하기 위해 검체의 전처리가 필요한 경우가 많음)을 비롯한 몇 가지 제한 사항도 있습니다.10을 클릭합니다.
캄필로박터균 속(genus of Campylobacter) 내에서 C. jejuni와 C. coli는 대부분의 인간 캄필로박터 감염을 일으킵니다(각각 81% 및 8.4%)11. 둘 다 단극 편모 또는 양극성 편모를 포함하는 나선형 모양의 미세 호기성 및 호열성 박테리아입니다. 각 극에서 편모의 회전은 특징적인 코르크 마개 운동성의 주요 원동력이자 박테리아가 숙주 위장관의 점막 점막을 통해 헤엄칠 수 있도록 하기 때문에 발병에 결정적인 것으로 간주됩니다. 캄필로박터균의 운동성은 세포가 유리한 환경으로 이동할 수 있도록 하는 화학감각 시스템에 의해 조절된다12,13. 캄필로박터균의 세포 형태 및 생리학적 특성에 기초하여, 몇몇 연구에서는 분변 및 환경 시료로부터 캄필로박터 종(Campylobacter spp.)을 분리하기 위해 막 여과를 활용하였다 14,15,16.
이 연구는 날고기에서 C. jejuni 및 C. coli 의 분리 및 후속 검출을 위한 빠르고 강력한 프로토콜을 제시하여 기존 방법의 단점을 극복하고 몇 가지 이점을 제공합니다. 잠정 콜로니는 현미경, 생화학적 검사(예: 카탈라아제 및 산화효소 활성 분석) 또는 분자 분석과 같은 다양한 방법을 사용하여 캄필로박터 종으로 확인할 수 있다6. 이 방법은 C. jejuni 및 C. coli 에 고유한 유전자를 표적으로 하는 multiplex real-time PCR(mqPCR) 분석을 사용하여 종 수준에서 분리물을 식별합니다. 이 방법은 비교적 저렴하고 빠르며 선택적이므로 식품 가공 시설, 임상 실험실 및 연구 실험실을 포함한 다양한 환경에서 사용하기에 적합합니다.
Protocol
이 프로토콜과 관련된 모든 작업은 무균 상태를 유지하고 시료 오염 또는 작업자가 미생물 병원체에 노출될 위험을 최소화하기 위해 생물 안전 작업대(BSC) 내에서 수행되어야 합니다. BSC 외부로 시료를 옮길 때는 밀봉된 용기를 사용하여 우발적인 낙하 시 유출을 방지하고 시료 무결성을 유지하십시오. 바람직하게는, 교차 오염의 가능성을 완화하기 위해 절차 전반에 걸쳐 일회용 구성 요소를 사용해야 합니다. 일회용품을 사용할 수 없는 경우 사용하기 전에 모든 장비와 재료가 멸균되었는지 확인하십시오. 적절한 폐기물 관리는 매우 중요합니다. 사용한 모든 일회용 구성 요소는 생물학적 위험 폐기물로 폐기해야 합니다. 적절한 멸균을 보장하고 잠재적으로 위험한 물질의 격리를 방지하기 위해 폐기하기 전에 재료를 오토클레이브하십시오. 이러한 예방 조치를 준수하면 시료 무결성을 보호할 뿐만 아니라 작업자가 미생물 병원균에 노출될 위험을 최소화할 수 있습니다. 그림 1 은 캄필로박터 종의 시료 전처리, 선택적 농축, 필터 기반 분리 및 mqPCR 분화의 워크플로우를 보여줍니다. 보충 파일 1 은 프로세스 전반에 걸쳐 보다 자세한 워크플로와 이미지를 보여줍니다.
1. 육류 샘플 준비
- 육류 샘플 채취
- 현지 소매점에서 닭 허벅지살, 날개, 닭다리, 간 등 다양한 신선한 고기 패키지를 구입하세요.
- 모든 시료를 4°C의 보관지로 옮기고 수령 후 24시간 이내에 처리합니다.
알림: 신선한 s를 보관하는 samples는 영하와 같은 낮은 온도에서 회복에 영향을 미칩니다.
- 육류 샘플 가공
- FSIS 샘플링 지침 6,17에 규정된 성분의 비율을 따르십시오.
- 각 포장에서 닭고기 조각 450g을 잘라 위장 가방에 넣습니다( 재료 표 참조).
알림: Stomacher 백은 다운스트림 프로세스를 보장하기에 충분한 기계적 강도를 가지고 있고 파열되거나 누출되지 않기 때문에 권장됩니다. - 완충형 펩톤수(BPW)를 준비합니다.
- 정제수 20L에 분말 1g( 재료 표 참조)을 녹입니다. 용액을 121°C에서 15분 동안 고압멸균합니다. 용액을 멸균수에 0.1% 농도로 희석합니다.
- 닭고기가 들어있는 위장 백에 0.1 % BPW 200mL를 추가합니다.
- 수동으로 마사지/촉진 샘플 위장 주머니 외부에서 2분 동안 촉진합니다.
- 전동 피펫 컨트롤러를 사용하여 백의 여과된 면에서 모든 치킨 린스를 수집합니다( 재료 표 참조).
- 닭고기 린스를 멸균 원심분리기 병에 넣습니다. 실온에서 10분 동안 10,000 x g 으로 원심분리합니다.
- 25mL 일회용 혈청학적 플라스틱 피펫이 있는 전동 피펫 컨트롤러를 사용하여 상층액을 조심스럽게 수집합니다. 펠릿을 방해하지 마십시오.
- 모든 상층액이 제거되었는지 확인하기 위해 필요에 따라 프로세스를 반복합니다.
- 수집된 상층액을 폐기하십시오.
2. 날고기에서 캄필로박터의 선택적 농축
- 보충제를 곁들인 Bolton Broth 준비
- 정제수 500mL에 분말 13.8g( 재료 표 참조)을 녹입니다. 121°C에서 15분 동안 고압멸균하여 육수를 살균합니다.
- 멸균된 500mL Bolton 육수에 25mL의 호수 말피( 재료 표 참조)를 추가합니다.
알림: 말의 혈액을 첨가하면 산소 담금질제 역할을 하여 식품 매트릭스에서 손상된 캄필로박터 세포의 회복을 돕습니다. - 항생제 보충제(세포페라존, 시클로헥시미드, 트리메토프림, 반코마이신, 재료표 참조) 1바이알을 5mL 50% 에탄올로 재구성합니다.
- 재구성 된 항생제 보충제를 Bolton Broth에 첨가하십시오.
- 보강 절차
- 호수에 탄 말의 피와 항생제가 들어 있는 50mL Bolton Broth에 펠릿을 재현탁시킵니다.
- 85 % N2 , 10 % CO2 및 5 % O2 의 가스 혼합물을 유지하는 밀봉 된 용기 안에 샘플 (느슨한 캡 포함)을 놓습니다.
- 캡이 느슨한지 확인하되 용기가 단단히 밀봉되어 Campylobacter의 미세 호기성 및 호열성 성장 요구 사항을 생성합니다.
알림: 85 % N2 , 10 % CO2 및 5 % O2 의 대기를 유지하는 가스 팩은 환경 챔버를 사용할 수없는 경우 사용할 수 있습니다. - 샘플을 42°C에서 24시간 동안 배양합니다.
- 캡이 느슨한지 확인하되 용기가 단단히 밀봉되어 Campylobacter의 미세 호기성 및 호열성 성장 요구 사항을 생성합니다.
3. 생닭에서 C. jejuni 및 C. coli의 분리 및 정제
- 브루셀라 한천 플레이트의 준비
- 브루셀라 가루 28g( 재료 표 참조)을 정제수 1L에 녹입니다. 한천 15g을 브루셀라 용액에 녹입니다.
- 121°C에서 15분 동안 고압멸균하여 Brucella 한천을 멸균합니다. 중간 한천 혼합물을 55°C 수조에서 식힙니다.
- 각 직경 100mm의 페트리 접시에 브루셀라 한천 20mL를 붓습니다.
- 필터 방법 및 콜로니 재배
- 0시간, 1시간, 2시간 및 3시간 동안 생물안전 캐비닛에서 뚜껑이 열린 Brucella 한천 플레이트를 건조하여 필터를 통과하는 캄필로박터 에 대한 수분의 영향을 평가합니다.
- 80μL의 시료를 Brucella 한천 플레이트에 직접 뿌려 노필터 대조군을 준비합니다.
- 셀룰로오스 아세테이트 필터(0.45μm 또는 0.65 기공 크기, 재료 표 참조)를 Brucella 한천 플레이트의 중앙에 놓습니다.
- 필터당 4방울 및 농축된 시료 20μL/방울을 필터에 피펫팅합니다.
- 플레이트에 도달하는 액체가 필터 주변이 아닌 필터를 통과하도록 필터 중앙 근처에 방울을 놓습니다.
- 방울이 퍼지거나 뭉치지 않도록 배치하십시오.
- 방울을 실온에서 15분 동안 배양하고 필터를 조심스럽게 제거합니다.
참고: 이 단계는 캄필로박터 세포가 멤브레인을 가로질러 과도한 건조 없이 한천 배지에 도달할 수 있는 충분한 시간을 허용합니다. - 플레이트를 42°C에서 앞서 설명한 미세 호기성 조건에서 약 24시간 동안 배양합니다.
- 특정 특성을 가진 특징적인 캄필로박터 군체를 선택하십시오.
참고: 캄필로박터 군집은 일반적으로 둥글고 가장자리가 매끄럽고 반짝이며 반투명하고 황색 또는 분홍빛을 띤다6. - 정제를 위해 Brucella 한천 접시에 군체를 줄무늬로 만듭니다. 단일 균일한 콜로니 형태를 가진 플레이트가 얻어질 때까지 이 단계를 반복합니다.
- 장기 보관을 위해 샘플을 준비합니다.
- 앞에서 설명한 대로 Bolton Broth를 준비합니다. 균일한 콜로니 형태를 가진 플레이트에서 콜로니 하나를 추가합니다.
- 앞서 설명한 미세 호기성 조건에서 하룻밤(24시간) 동안 성장합니다. 100μL의 DMSO가 들어 있는 2mL cryovial에 900μL의 야간 배양액을 추가합니다.
- 드라이아이스-에탄올 수조(약 -72°C)에서 10분 동안 급속 냉각합니다. 장기 보관을 위해 -80 °C 냉동고로 옮깁니다.
4. C. jejuni 및 C. coli 종의 동정
- 이전에 개발된 다중 qPCR(mqPCR) 분석을 사용하여 C. jejuni 및 C. coli의 종 수준 식별을 수행합니다18,19.
- 96웰 플레이트 형식으로 신속한 세포 용해 및 게놈 DNA 추출을 수행합니다.
참고: 시료에 알려진 PCR 억제제가 충분히 없는지 확인하기 위해 상용 키트( 재료 표 참조)를 사용하는 것이 좋습니다.- 정제된 캄필로박터 콜로니를 100μL의 추출 용액에 분산시킵니다.
- 시료를 99°C에서 10분 동안 용해한 후 열순환기에서 20°C에서 2분 동안 냉각합니다.
- 플레이트를 실온에서 8,000 x g 에서 10분 동안 원심분리합니다. mqPCR 분석을 위해 상층액의 분취액 2μL를 제거합니다.
- 10μL의 2x Master Mix, 2.0μL의 DNA 샘플, 10개의 IAC(Internal Amplification Control) 템플릿4 개, 각 프라이머 및 프로브 200nM으로 구성된 20μL 반응 혼합물을 준비합니다( 재료 표 참조).
참고: hipO 및 cdtA 의 프라이머와 프로브는 각각 C. jejuni 및 C. coli의 독점적인 표적 유전자입니다. IAC는 인간 아데노바이러스의 79-bp DNA 세그먼트로 구성되며 모든 샘플에서 DNA 중합효소의 일관된 활성을 보장하기 위해 양성 대조군으로 포함됩니다.
- 광학 필름으로 덮인 96웰 광학 플레이트에 모든 샘플을 삼중으로 로드하고 Real-Time PCR 시스템에 넣습니다( 재료 표 참조).
- 95°C에서 10분 동안 DNA 중합효소의 핫 스타트 활성화를 시작합니다. 95°C에서 15초 동안 40회 변성하고 60°C에서 1분 동안 어닐링/연장합니다.
- 96웰 플레이트 형식으로 신속한 세포 용해 및 게놈 DNA 추출을 수행합니다.
5. 세포 현탁액 열거
- 6 x 6 드롭 플레이트 절차를 사용하여 세포 현탁액을 열거합니다20. 보충 자료 참조 File 6 x 6 드롭 플레이트 방식을 묘사한 이미지는 1.
- Brucella 한천 플레이트를 층류 후드에서 45분 동안 뚜껑을 닫은 상태로 자연 건조합니다.
- 200μL의 박테리아 현탁액을 96웰 플레이트의 첫 번째 열에 있는 6열(A-F)에 추가합니다.
- 180μL의 Brucella 배지를 나머지 컬럼(2-12)의 6개 행에 분배합니다.
- 20μL 전송을 사용하여 10배 연속 희석액을 준비합니다.
- 예를 들어, 20μL의 시료를 1열에서 2열로 옮깁니다. 최소 6개의 열에 대해 이 과정을 반복합니다.
- 피펫을 사용하여 각 현탁액을 10회 환류하여 각 이송 사이에 팁을 변경합니다.
- 멀티채널 피펫을 사용하여 Brucella 한천 플레이트 표면의 컬럼 6열에서 7μL 방울을 증착합니다.
- 이 단계를 반복하여 6 x 6 배열을 만들고 행이 열 간에 기술 반복실험이 되도록 합니다.
- 플레이트를 5분 동안 자연 건조시킨 다음 플레이트를 뒤집습니다. 플레이트를 42°C에서 24시간 동안 배양합니다.
- 각 대표 희석액의 콜로니 수를 계산합니다.
Representative Results
캄필로박터의 수동 여과를 위한 Brucella 한천 플레이트의 수분 효과
캄필로박터는 게놈이 작고 대장균 O157:H7 및 살모넬라균과 같은 다른 박테리아에서 흔히 발생하는 몇 가지 스트레스 반응 유전자가 부족합니다. 따라서 다양한 환경 스트레스에 더 민감하며 탈수나 주변 산소 수준을 견딜 수 없습니다. 반대로, 지나치게 축축한 한천 배지는 필터를 범람시킬 수 있습니다. 이것은 샘플이 필터 외부로 확산되는 것을 야기할 뿐만 아니라, 산소에 대한 노출 시간을 증가시킨다(21).
캄필로박터의 필터 기반 분리를 위한 적절한 조건을 결정하기 위해, 브루셀라 한천 플레이트를 생물 안전 캐비닛 내에서 0시간, 1시간, 2시간 및 3시간 동안 뚜껑을 제거한 상태로 건조하고 0.65μm 공극 크기 필터를 통과하는 캄필로박터 세포의 효율성을 평가했습니다. 1.53 x 104 및 1.53 x 105 CFU/mL 농도의 C. jejuni S27 배양액 20μL 분취액 4개를 브루셀라 플레이트 위에 놓인 각 필터 멤브레인에 피펫으로 처리했습니다. 15분 침투 후 필터를 제거하고 세포 성장을 위해 플레이트를 밤새 배양했습니다.
그런 다음 5개의 복제된 플레이트에서 세포를 계수하고 표 1에 기록했습니다. 그 결과, 2시간 및 3시간 동안 건조된 한천 플레이트는 수동 여과로부터 회수된 세포의 수가 거의 동일하여 유사하게 수행되었음을 나타냈다. 주목할 만하게도, 이러한 조건 하에서 0시간 및 1시간 동안 건조된 플레이트는 세포가 사용된 15분 시간 내에 멤브레인을 완전히 가로지르는 것을 허용하지 않았다.
닭 간에서 캄필로박터를 분리하기 위한 다양한 기공 크기 필터 멤브레인 비교
캄필로박터 세포 크기(길이 0.5-5μm, 너비 0.2-0.9μm)와 광범위한 식품 입자 크기를 고려하여 0.45μm 및 0.65μm 기공 크기의 셀룰로오스 아세테이트 필터에 15분의 배양 시간이 주어졌을 때 캄필로박터 통과 효율성을 테스트했습니다. 닭 간 450g에 C. jejuni 153 CFU를 첨가한 후 밤새 농축한 식품 샘플을 실험에 사용했습니다. no-filter control로서, 농축 시료의 직접 도금을 병렬로 포함시켰다. 5개의 복제 플레이트의 결과(그림 2)는 0.65μm 공극 크기 필터가 0.45μm 공극 크기 필터보다 더 많은 세포를 통과할 수 있도록 하여 ~29배 더 많은 세포를 얻을 수 있음을 일관되게 보여주었습니다. 0.45μm 공극 크기 필터는 필터 상부에 너무 많은 세포를 유지하여 0.65μm 공극 크기 필터에 비해 음식물에서 캄필로박터 회수율이 현저히 낮았습니다. 예상했던 대로, 필터가 없는 대조판에는 다양한 배경 유기체가 자라는 잔디밭이 있었습니다.
소매 닭고기의 Campylobacter 분리에 수동 여과 적용
캄필로박터 세포의 특이한 운동성으로 인해, 일반적으로 수많은 배경 유기체로 오염된 소매 육류 제품에서 C. jejuni 및 C. coli를 분리하기 위해 수동 여과 기술이 선택되었습니다. 2014년부터 2023년까지 닭고기, 닭 간, 소 간, 송아지 간의 다양한 부위를 포함한 총 79개의 생고기 패키지가 여러 지역 슈퍼마켓에서 수집되었습니다. 각 패키지에서 450g을 샘플링하여 Campylobacter spp의 분리를 수행했습니다. 혈액 함유 볼튼 브로스에서 캄필로박터의 선택적 농축과 0.65μm 공극 크기의 셀룰로오스 아세테이트 필터를 통한 세포의 수동 여과를 브루셀라 한천 플레이트에 직접 결합함으로써 79개의 육류 샘플에서 49개의 캄필로박터 균주를 성공적으로 분리했습니다(표 2). 그림 3은 닭 간에서 새로운 캄필로박터 균주를 분리한 결과입니다. 이 방법은 민감하고 구체적이며 비용 효율적인 것으로 반복적으로 입증되었습니다.
C. jejuni 및 C. coli 분리물의 식별 및 분화
생고기에서 얻은 캄필로박터 분리물의 속을 확인하고 종을 구별하기 위해 C. jejuni 및 C. coli에 대한 특정 유전자 표적(hipO 및 cdtA)을 증폭하는 다중 qPCR 분석과 내부 증폭 제어(IAC)를 사용했습니다. IAC는 여러 유전자의 동시 증폭에서 위음성 지표로 포함되었습니다. 분석은 시판되는 시약을 사용하여 신속한 세포 용해 및 DNA 추출과 함께 96웰 형식으로 구현되었습니다(재료 표 참조). 표 2는 C. jejuni 및 C. coli 균주의 종 동정 결과를 요약한 것이다. 추가 검증으로, 전체 게놈 염기서열 분석 결과, 모든 분리물의 종을 확인했다(데이터는 표시되지 않음).
그림 1: 소매된 육류에서 캄필로박터 종을 분리하고 식별하기 위한 워크플로우 다이어그램. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 필터 크기가 캄필로박터 회수율에 미치는 영향. 결과는 0.65 μm 필터가 평균 900 ± 138 콜로니를 회수할 수 있는 반면, 0.45 μm 필터는 31 ± 7 콜로니를 회수할 수 있음을 나타냅니다. 결과는 N = 20(접시 4방울이 있는 접시 5개)에서 생성되었으며 스튜던트 t-검정 은 평균이 통계적으로 다르다는 것을 나타냅니다(p < 0.0001). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 농축된 가금류 샘플의 수동 여과에 의한 캄필로박터 의 분리. (A) 니트로셀룰로오스 멤브레인 필터에 증착된 농축 시료의 20μL 방울 4개를 보여줍니다. 이미지는 수동 여과의 15분 동안 수집되었습니다. (B) 니트로셀룰로오스 필터를 제거한 후의 플레이트를 묘사합니다. 4개의 지점은 농축된 샘플이 멤브레인을 통과한 위치를 나타냅니다. (C) 24시간 배양 후의 플레이트를 묘사합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: 브루셀라 한천 플레이트의 건조 시간이 C. jejuni의 수동 여과에 미치는 영향. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 2: C. jejuni 및 C. coli 균주생고기에서 분리. 2008년부터 2023년까지의 기간 동안 24개의 고유한 소매 제품에 걸쳐 79개의 육류 패키지에서 36개의 C. jejuni 균주와 13개의 C. coli 균주가 분리되었습니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 1: 격리 및 열거 프로세스 전반의 이미지. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
프로토콜의 중요성
C. jejuni와 C. coli는 가금류22 및 동물 간 23,24에서 널리 퍼져 있는 것으로 밝혀진 캄필로박터의 두 가지 주요 종이었다. 이 연구에서는 닭 부위(다리, 날개, 허벅지), 닭 간 및 소 간의 육류 샘플을 캄필로박터 종(Campylobacter spp)의 분리를 위해 서로 다른 기간 동안 다른 소매점 및 제조업체에서 무작위로 수집했습니다. 분리된 총 49종의 캄필로박터 균주 중 36종은 C. jejuni, 13종은 대장균으로 확인되었으며, 다른 캄필로박터 종은 발견되지 않았으며, 이는 다른 보고와 일치한다25.
이 분석은 Campylobacter spp.의 나선형 세포 형태와 특징적인 코르크 마개 모양의 운동성을 기반으로 합니다. 나선형 세포 형태 (길고 가느다란 0.2-0.9 x 0.5-5 μm)와 강한 코르크 마개 운동성을 이용한 간단하지만 효과적인 수동 여과 기술26,27을 사용하여 배경 유기체의 혼합물로부터 캄필로박터를 분리했습니다. 캄필로박터의 높은 운동성은 세포가 멤브레인 필터를 통과하여 한천 배지 내에서 발견되는 유리한 조건으로 이동할 수 있도록 하는 반면, 육류 제품의 다른 배경 미생물은 통과할 수 없었습니다. 이 방법은 비교적 저렴하고 빠르며 선택적이므로 식품 가공 시설, 임상 실험실 및 연구 실험실을 포함한 다양한 환경에서 사용하기에 적합합니다.
자주 인용되는 선구적인 논문에 따르면 0.45μm 필터가 너무 잘 작동하여 0.65μm는 평가되지 않았다고 합니다28. 본 연구의 결과는 0.65μm 공극 크기 필터가 0.45μm 공극 크기보다 훨씬 더 나은 성능을 발휘하여 농축에서 회수된 세포 수가 29배 증가했음을 나타냅니다. 이는 선택된 필터들이 이전에 보고된 바와 같이 감소된 선택성을 나타내지 않기 때문에 중요하다29. 또한, 여과는 직접 도금(30)에 비해 회수된 캄필로박터의 양을 현저히 감소시키는 것으로 알려져 있으며, 따라서 기공의 크기를 증가시키는 것은 미생물의 회복을 향상시키며, 이는 이전에 보고된 결과와 일치한다(21). 이는 필터를 통과하는 모든 세포가 균일한 캄필로박터 군집을 형성했기 때문에 중요하며, 이는 두 필터 모두 다른 미생물 및 식품 입자가 통과하는 것을 방지하기에 충분함을 나타냅니다. 또한 FSIS 흐름도7은 항생제가 포함된 Campy-Cefex 플레이트의 재줄무늬 분리로 인해 결과 생산이 연장될 수 있는 가능성에 주목합니다. 대조적으로, 이 원고에 설명된 프로토콜은 여과 및 선택적 농축의 사용을 세포페라존, 사이클로헥시미드, 트리메토프림 및 반코마이신과 결합하며, 재-스트리킹을 필요로 하지 않습니다.
현재 사용되는 방법은 현재 FSIS 샘플링 및 검증 프로그램17과 일치합니다. 캄필로박터 오염 수준이 낮을 수 있으므로(153 CFU/450 g 닭고기) 헹굼 시 원심분리하여 샘플을 4배 농축하여 분석의 감도를 높입니다. 헹굼수를 4배 농축한 후 샘플을 48시간 동안 농축하고 분자 검출 시스템(MDS)으로 스크리닝하여 FSIS 실험실에서 사용하는 방법을 복제합니다(데이터는 표시되지 않음). 특히, 설명된 방법은 48시간의 농축을 사용하여 분자 검출 시스템에 의해 검출된 24시간 이내에 양성 균주를 식별하지 못했습니다(데이터는 표시되지 않음). 마지막으로, 이 프로토콜의 또 다른 이점은 박테리아 종과 관련된 정보를 제공하고 캄필로박터 가 C.coli, C. jejuni 또는 C. lari인지 식별할 수 있는 반면, MLG 41.07에서 채택된 MDS는 캄필로박터에 대한 이분법적 양성/음성 반응만 제공할 수 있다는 것입니다.
중요 단계
캄필로박터 분리 및 식별을 위한 프로토콜은 원심분리, 여과 및 분자 분석 중에 정밀도를 필요로 합니다. 정확한 희석, 적절한 배양 조건 및 qPCR 분석 조건에 대한 세심한 준수는 신뢰할 수 있는 종 식별에 중추적인 역할을 합니다.
미세 호기성 박테리아인 캄필로박터는 매우 연약하고 다양한 환경 스트레스에 민감하며 성장을 위해서는 독특하고 까다로운 조건이 필요합니다 31,32,33. 전형적으로 장시간의 운송 및 보관을 거치는 식품 샘플에서, 많은 캄필로박터 세포는 아마도 휴면 상태 또는 준치사/치사적 손상 상태에 있을 것이다34,35. 따라서 식품 매트릭스에서 스트레스를 받은 세포를 회수하고 더 높은 농도로 성장시키는 것이 중요합니다. 시술의 첫 번째 단계에서, 우리는 음식에서 캄필로박터를 선택적으로 농축하기 위해 호수 말의 혈액과 항생제를 보충한 Bolton Broth를 사용했습니다. 첨가 혈액은 자유 산소 라디칼36의 부작용을 극복하기 위해 산소 담금질제 역할을 했다. 항생제는 배경 미생물37의 성장을 억제하기 위해 사용되었다.
주변 대기 산소에 대한 캄필로박터 의 노출 시간을 최소화하기 위해 세포가 필터를 통과할 수 있도록 15분의 배양 기간을 선택했습니다. 또한 필터 아래의 Brucella 한천 플레이트의 수분은 통과 속도에 중요한 역할을 했습니다. 특히, 0시간, 1시간, 2시간 및 3시간 동안 건조된 한천 플레이트를 테스트한 결과는 필터의 높은 수분 함량이 세포를 통과시키는 것을 방지한다는 것을 시사했습니다. 플레이트와 필터에 필터와 방울을 정확하게 배치하는 것도 마찬가지로 중요하며, 이 두 가지 모두 세포 분리의 성공에 영향을 미칩니다.
잠재적 위험 및 한계
생닭 샘플에서 캄필로박터 종을 분리하고 식별하기 위한 구조화된 접근 방식을 제시하는 동안 이 프로토콜의 몇 가지 제한 사항에 주의를 기울일 필요가 있습니다. 외부 오염, 불충분하게 건조된 플레이트, 미생물 이동을 방해하는 필터 막힘, 펠릿 내 미생물 포집, 대기 챔버의 불완전한 밀봉, 필터 경계를 넘어 퍼지는 방울이 주요 위험 중 하나입니다.
식품 표면에서 미생물을 부적절하게 분리하거나 샘플의 벌크 내에 미생물을 가두면 이 방법을 사용하여 미생물을 분리하는 데 방해가 될 수 있습니다. 또한 패시브 필터를 통과하기 위해 미생물 운동성에 의존하는 것은 주목할 만한 한계가 있습니다. 필터막이 운동성이 다소 덜한 캄필로박터 균주를 유지했을 가능성이 있는데, 이는 필터가 식품 내 미생물 병원체의 포획 효율을 감소시킬 수 있다는 것이 나타난 바와 같다38. 추가 제한 사항에는 원심분리 및 여과 공정의 배치 특성, 필터 막힘에 대한 민감성, 형성된 펠릿 분산의 비효율성이 포함되며, 이는 미생물 부하의 정확도에 영향을 미칩니다. 이러한 한계는 특히 다양한 시료 유형을 다루거나 고처리량 기능을 추구할 때 포괄적인 분석을 보장하기 위한 주의 및 보충 방법론의 필요성을 강조합니다.
문제 해결을 위한 제안
잠재적인 문제를 미연에 방지하려면 먼저 모든 재료가 필요한 품질 표준을 준수하고 만료되지 않았는지 확인합니다. 니트로셀룰로오스 멤브레인을 통한 캄필로박터 의 통과를 제한할 수 있는 큰 오염 물질을 제거하기 위해 잠재적으로 추가 여과를 사용하여 막힌 필터 문제를 해결하십시오. 오염이 관찰되면 방울이 필터 가장자리에 너무 가깝게 배치되지 않았는지 확인하고 액체가 기공을 통과하지 않고 필터 주위를 이동하여 한천에 도달하도록 합니다. 농축 후 성장이 충분하지 않은 경우 대기 용기의 밀봉이 단단하고 누출되지 않는지 확인하십시오.
잠재적인 개선 및 확장
대체 필터 재료를 탐색하면 미생물 통과를 향상시킬 수 있으며 식품과 같은 이종 혼합물에서 다른 운동성 미생물을 분리하는 데 사용할 수 있도록 이 프로토콜을 확장할 수 있습니다. 특이성에 부정적인 영향을 미치지 않으면서 운동성이 낮은 캄필로박터 변이체를 유지하기 위한 대조군을 식별하는 것이 좋습니다. 또한 이 연구에 사용된 다중 qPCR 분석은 C.lari18 을 검출할 수 있는 능력이 있는 것으로 입증되었지만 이 분석에는 관심 있는 다른 캄필로박터 종이 포함될 수 있습니다.
요약하면, 다양한 파라미터와 설정을 평가하여 식품에서 C. jejuni 및 C. coli 의 필터 기반 분리 및 종 수준 식별을 위한 적절한 조건을 설정했습니다. 이 방법은 민감하고, 구체적이며, 강력하고, 비용 효율적인 것으로 입증되었습니다. 이 프로토콜은 이를 실제 식품 샘플에 적용하여 79개의 육류 포장에서 36 개의 C. jejuni 균주와 13개의 C. coli 균주를 분리할 수 있었습니다.
이 프로토콜은 생닭 부위 샘플링 절차를 설명하는 FSIS 지침 10,250.117과 캄필로박터의 분리 및 식별을 위한 MLG 41.076에 부합합니다. 데이터에 따르면 샘플을 4배 농축하고 여과 및 도금과 함께 24시간 동안 농축하면 96시간이 아닌 48시간 이내에 분리되고 확인된 콜로니가 생성됩니다. 이 프로토콜은 게놈 염기서열 분석과 같은 DNA 기반 방법과 호환되어 항균 내성 프로필, 독성 예측 및 계통발생 관계를 포함하여 캄필로박터 균주의 포괄적인 특성 분석을 제공합니다. 이 프로토콜은 생 가금류에서 Campylobacter spp.의 효율적인 회수 및 격리를 위한 유망한 대안을 제시하며, 이는 역학 연구 및 공중 보건 개입을 촉진할 수 있습니다.
Disclosures
모든 저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 미국 농무부 농업 연구 서비스(USDA-ARS), 국가 프로그램 108, 현재 연구 정보 시스템 번호 8072-42000-093 및 8072-42000-094-000-D의 지원을 받았습니다. 이 문서에서 상표명 또는 상업용 제품에 대한 언급은 특정 정보를 제공하기 위한 목적으로만 사용되며 미국 농무부의 권장 또는 보증을 의미하지 않습니다. USDA는 기회 균등 제공자이자 고용주입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar - Solidifying Agent (Difco) | Becton, Dickinson and Company (BD) | 281230 | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo | JL602-G/L | Equipment |
| Analytical Balance | Mettler Toledo | AB54-S | Equipment |
| Antibiotic supplements cefoperazone, cycloheximide, trimethoprim, vancomycin | Oxoid Ltd. | SR0183E | |
| Atmosphere Control Gas Pak (Campy, 85% N2, 10% CO2, and 5% O2) | Becton, Dickinson and Company (BD) | 260680 | |
| Atmosphere Control Vessel, GasPak EZ CampyPak container system | Becton, Dickinson and Company (BD) | 260678 | |
| Autoclave - Amsco Lab250, Laboratory Steam Sterilizer | Steris plc | LV-250 | Equipment |
| Biological Safety Cabinet, Type A2, Purifier Logic+ | Labconco Corporation | 302411101 | Equipment |
| Bolton broth | Oxoid Ltd. | CM0983 | |
| Brucella broth (Difco) | Becton, Dickinson and Company (BD) | 211088 | |
| Buffered Peptone Water | Bio-Rad Laboratories Inc. | 3564684 | |
| Centrifuge Microcentrifuge 5424 | Eppendorf | 5424 | Equipment |
| Centrifuge, Avanti J-25 | Beckman Coulter, Inc. | Equipment | |
| Chicken thighs, wings, drumsticks, livers | Local retailers | ||
| DNA Extraction - PreMan Ultra Sample Preparation Reagent | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4318930 | |
| FAM probe for hipO (Sequence 5'-TTGCAACCTCACTAGCAAAATCC ACAGCT-3') |
Integrated DNA Technologies | ||
| Filter - 0.45 µm sterile cellulose acetate filter | Merck-Millipore LTD | DAWP04700 | |
| Filter - 0.65 µm sterile cellulose acetate filter | Merck-Millipore LTD | HAWG04700 | |
| forward primer for cdtA (Sequence 5'-TGTCAAACAAAAAACACCAAGCT T-3' ') |
Integrated DNA Technologies | ||
| forward primer for hipO (Sequence 5'-TCCAAAATCCTCACTTGCCATT-3') | Integrated DNA Technologies | ||
| forward primer for IAC (Sequence 5'-GGCGCGCCTAACACATCT-3') | Integrated DNA Technologies | ||
| HEX probe for cdtA (Sequence 5'-AAAATTTCCCGCCATACCACTTG TCCC-3') |
Integrated DNA Technologies | ||
| Incubator - Inova 4230 refrigerated incubator shaker | New Brunswick Scientific | 4230 | Equipment |
| Inoculating Loop - Combi Loop 10µL and 1µL | Fisher Scientific International, Inc | 22-363-602 | |
| Internal Amplification Control (IAC) DNA fragment (Sequence 5'-TGGAAGCAATGCCAAATGTGTAT GTGGTGGCATTGTCTTCTCCC GTTGTAACTATCCACTGAGATG TGTTAGGCGCGCC-3') |
Integrated DNA Technologies | ||
| Laked horse blood | Remel Inc. | R54072 | |
| Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+ | Mettler Toledo | 17014382 | Equipment |
| Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-100XLS+ | Mettler Toledo | 17014384 | Equipment |
| Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+ | Mettler Toledo | 17014388 | Equipment |
| Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+ | Mettler Toledo | 17014391 | Equipment |
| Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+ | Mettler Toledo | 17014392 | Equipment |
| Manual pipette Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+ | Mettler Toledo | 17013805 | Equipment |
| Manual pipette Pipet-Lite Multi Pipette L8-20XLS+ | Mettler Toledo | 17013803 | Equipment |
| Media Storage Bottle -PYREX 1 L Square Glass Bottle, with GL45 Screw Cap | Corning Inc. | 1396-1L | Equipment |
| Media Storage Bottle -PYREX 2 L Round Wide Mouth Bottle, with GLS80 Screw Cap | Corning Inc. | 1397-2L | Equipment |
| Microtiter plate, 96 well plate, flat bottom, polystyrene, 0.34 cm2, sterile, 108/cs | MilliporeSigma | Z707902 | |
| Mixer - Vortex Genie 2 | Scientific Industries Inc. | SI-0236 | Equipment |
| Motorized pipette controller, PIPETBOY2 | INTEGRA Biosciences Corp. | Equipment | |
| PCR Mastermix 2× TaqMan Gene Expression | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4369542 | |
| Petri Dish Rotator - bioWORLD Inoculation Turntable | Fisher Scientific International, Inc | 3489E20 | Equipment |
| Petri Dishes with Clear Lid (100 mm x 15mm) | Fisher Scientific International, Inc | FB0875713 | |
| Pipette Tips GP LTS 1000µL S 768A/8 | Mettler Toledo | 30389273 | |
| Pipette Tips GP LTS 20µL 960A/10 | Mettler Toledo | 30389270 | |
| Pipette Tips GP LTS 200µL F 960A/10 | Mettler Toledo | 30389276 | |
| Reagent Reservoir, 25 mL sterile reservoir used with multichannel pipettors | Thermo Fisher Scientific Inc. | 8093-11 | |
| Realtime PCR - 7500 Real-Time PCR system | (Applied Biosystems, Foster City, CA) | Equipment | |
| reverse primer for cdtA (Sequence 5'-CCTTTGACGGCATTATCTCCTT-3') | Integrated DNA Technologies | ||
| reverse primer for hipO (Sequence 5'-TGCACCAGTGACTATGAATAACG A-3') |
Integrated DNA Technologies | ||
| reverse primer for IAC (Sequence 5'-TGGAAGCAATGCCAAATGTGTA -3') |
Integrated DNA Technologies | ||
| Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (10 mL) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 170356N | |
| Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (2 mL) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 170372N | |
| Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (25 mL) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 170357N | |
| Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (50 mL) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 170376N | |
| Spreader - Fisherbrand L-Shaped Cell Spreaders | Fisher Scientific International, Inc | 14-665-230 | |
| Stomacher bag, Nasco Whirl-Pak Write-On Homogenizer Blender Filter Bags | Thermo Fisher Scientific Inc. | 01-812 | |
| TAMRA probe for IAC (Sequence 5'-TTACAACGGGAGAAGACAATGCC ACCA-3') |
Integrated DNA Technologies | ||
| Thermocycler (GeneAmp PCR system 9700) | Applied Biosystems | Equipment | |
| Water Filtration - Elga Veolia Purelab Flex | Elga LabWater | PF2XXXXM1-US | Equipment |
References
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