Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Обнаружение и выделение Campylobacter spp. из сырого мяса

Published: February 23, 2024 doi: 10.3791/66462
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Characterization and Interventions for Foodborne Pathogens Research Unit, Eastern Regional Research Center, Agricultural Research Service (ARS), United States Department of Agriculture (USDA)

Summary

Кампилобактер является основной причиной бактериального гастроэнтерита пищевого происхождения во всем мире. Несмотря на то, что предприятия принимают меры по снижению распространенности инфекции на своих предприятиях, зараженная продукция постоянно попадает к потребителям. Методика, разработанная за последние двенадцать лет, направлена на устранение ограничений существующих методов выделения и обнаружения Campylobacter spp. из сырого мяса.

Abstract

В этой статье представлен быстрый, но надежный протокол выделения Campylobacter spp. из сырого мяса, в частности, Campylobacter jejuni и Campylobacter coli. Протокол основан на установленных методах, обеспечивающих совместимость с преобладающими методами, используемыми регулирующими органами, такими как Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) и Министерство сельского хозяйства США (USDA) в США, а также Международная организация по стандартизации (ISO) в Европе. Центральное место в этом протоколе занимает сбор полоскания, который концентрируется и ресуспендируется в среде Болтонского бульона, содержащей лошадиную кровь. Было доказано, что эта среда способствует восстановлению стрессовых клеток Campylobacter и сокращает необходимую продолжительность обогащения на 50%. Затем обогащенные образцы переносятся на нитроцеллюлозные мембраны на бруцелловых пластинах. Для повышения чувствительности и специфичности метода были оценены фильтрующие мембраны размером поры 0,45 мкм и 0,65 мкм. Данные показали 29-кратное увеличение восстановления клеток при использовании фильтра размером пор 0,65 мкм по сравнению с размером пор 0,45 мкм без ущерба для специфичности. Высокая подвижность Campylobacter позволяет клеткам активно перемещаться через мембранные фильтры к агаровой среде, что позволяет эффективно выделять чистые колонии Campylobacter . Протокол включает мультиплексный количественный анализ полимеразной цепной реакции в реальном времени (mqPCR) для идентификации изолятов на видовом уровне. Этот молекулярный метод является надежным и эффективным средством видовой идентификации. Исследования, проведенные в течение последних двенадцати лет с участием мяса, продаваемого в розничной торговле, продемонстрировали способность этого метода улучшать извлечение кампилобактера из естественно загрязненных образцов мяса по сравнению с существующими эталонными методами. Кроме того, этот протокол может похвастаться сокращенным временем подготовки и обработки. В результате, он представляет собой многообещающую альтернативу для эффективного извлечения Campylobacter из мяса. Кроме того, эта процедура может быть легко интегрирована с методами, основанными на ДНК, что способствует быстрому скринингу положительных образцов наряду с комплексным анализом полногеномного секвенирования.

Introduction

Campylobacter spp. являются ведущей причиной бактериального гастроэнтерита пищевого происхождения во всем мире, на который, по оценкам, ежегодно приходится 800 миллионов случаев1. Являясь основной зоонозной бактерией, Campylobacter естественным образом колонизирует желудочно-кишечный тракт широкого спектра животных, включая диких птиц, сельскохозяйственных животных и домашних животных. Во время убоя или переработки пищевых продуктов Campylobacter spp. часто загрязняют туши или мясные продукты3. Кампилобактериоз обычно связан с употреблением в пищу недостаточно термически обработанной птицы или перекрестным загрязнением других пищевых продуктов сырыми соками птицы2. Он может вызывать серьезные осложнения, такие как синдром Гийена-Барре, реактивный артрит и септицемия у лиц с ослабленным иммунитетом4. Выявление и изоляция кампилобактера из пищевых источников, особенно из продуктов птицеводства, имеет важное значение для эпиднадзора за состоянием общественного здравоохранения, расследования вспышек и оценки риска.

Традиционными методами, основанными на культуре, являются традиционные и стандартные методы обнаружения кампилобактера 5,6. Тем не менее, существует ряд ограничений, в том числе длительный инкубационный период (48 ч и более), низкая чувствительность (до 50%) и не все штаммы (некоторые стрессовые клетки Campylobacter могут плохо расти или вообще расти в среде)7. Молекулярные методы, такие как полимеразная цепная реакция (ПЦР), являются более быстрыми и чувствительными, чем методы, основанные на культивировании, но они не дают жизнеспособных изолятов для дальнейшей характеризации 8,9.

Иммунологические методы являются альтернативными и дополнительными методами выявления кампилобактера . Они быстры, просты и универсальны, но также имеют ряд ограничений, включая перекрестную реактивность (некоторые антитела могут связываться с бактериями, не относящимися к кампилобактеру , или другими веществами, имеющими сходные антигены), низкую специфичность (некоторые антитела могут не связываться со всеми штаммами или серотипами кампилобактеров ) и требования к подготовке образцов (иммунологические методы часто требуют предварительной обработки образцов для удаления мешающих веществ для усиления связывания антител)10См.

В пределах рода Campylobacter C. jejuni и C. coli вызывают большинство инфекций, вызванных Campylobacter у человека (81% и 8,4% соответственно)11. Обе представляют собой спиралевидные, микроаэрофильные и термофильные бактерии, содержащие униполярный жгутик или биполярный жгутик. Вращение жгутика на каждом полюсе считается как основной движущей силой его характерной штопорной подвижности, так и решающим для его патогенеза, поскольку оно позволяет бактерии плавать через вязкую слизистую оболочку желудочно-кишечного тракта хозяина. Подвижность Campylobacter контролируется его хемосенсорной системой, которая позволяет клеткам двигаться к благоприятной среде12,13. Основываясь на морфологии клеток и физиологических характеристиках Campylobacter, в нескольких исследованиях использовалась мембранная фильтрация для выделения Campylobacter spp. из образцов фекалий и окружающей среды 14,15,16.

В данном исследовании представлен быстрый и надежный протокол выделения и последующего выявления C. jejuni и C. coli из сырого мяса, который преодолевает недостатки существующих методов и имеет ряд преимуществ. Предварительные колонии могут быть подтверждены как Campylobacter spp. с помощью различных методов, таких как микроскопия, биохимические тесты (например, анализ активности каталазы и оксидазы) или молекулярные методы6. Метод идентифицирует изоляты на видовом уровне с помощью мультиплексного анализа ПЦР в реальном времени (mqPCR), который нацелен на гены, уникальные для C. jejuni и C. coli. Этот метод является относительно недорогим, быстрым и селективным, что делает его пригодным для использования в различных условиях, включая предприятия пищевой промышленности, клинические лаборатории и исследовательские лаборатории.

Protocol

Все работы, связанные с этим протоколом, должны проводиться в шкафу биологической безопасности (BSC) для поддержания асептических условий и сведения к минимуму риска загрязнения образца или воздействия на оператора микробных патогенов. При перемещении образцов за пределы ССП используйте герметичные контейнеры, чтобы предотвратить просыпание в случае случайного падения, сохраняя целостность пробы. Желательно, чтобы на протяжении всей процедуры использовались одноразовые компоненты, чтобы снизить вероятность перекрестного загрязнения. В тех случаях, когда одноразовые материалы нецелесообразны, перед использованием убедитесь, что все оборудование и материалы стерильны. Надлежащее управление отходами имеет решающее значение; Все использованные одноразовые компоненты должны быть утилизированы как биологически опасные отходы. Автоклавные материалы перед утилизацией, чтобы обеспечить надлежащую стерилизацию и избежать локализации потенциально опасных материалов. Соблюдение этих мер предосторожности не только обеспечивает целостность образца, но и сводит к минимуму риск контакта оператора с микробными патогенами. На рисунке 1 показан рабочий процесс пробоподготовки, селективного обогащения, выделения видов Campylobacter с помощью фильтра и дифференциации видов Campylobacter методом mqПЦР. В дополнительном файле 1 показан более подробный рабочий процесс и изображения на протяжении всего процесса.

1. Подготовка образцов мяса

  1. Получение образцов мяса
    1. Приобретайте различные упаковки свежего мяса, включая куриные бедра, крылышки, голени и печень в местных розничных магазинах.
    2. Переведите все образцы на хранение при температуре 4 °C и обработайте в течение 24 часов после получения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хранение свежих образцов при более низких температурах, например, ниже нуля, повлияет на восстановление.
  2. Обработка образцов мяса
    1. Соблюдайте соотношение компонентов, предписанное в соответствии с рекомендациями FSISпо отбору проб 6,17.
    2. Из каждой упаковки отрежьте по 450 г кусочков курицы и поместите их в пакет для желудка (см. Таблицу материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать мешки для желудка, потому что они обладают достаточной механической прочностью для обеспечения последующих процессов и не разрываются и не протекают.
    3. Приготовьте буферную пептную воду (BPW).
      1. Растворите 20 г порошка (см. таблицу материалов) в 1 л очищенной воды. Раствор автоклавируют при 121 °С в течение 15 мин. Разведите раствор в стерильной воде до концентрации 0,1%.
    4. Добавьте 200 мл 0,1% BPW в пакет с курицей.
    5. Вручную массируйте/пальпируйте образец с внешней стороны сумки для желудка в течение 2 минут.
    6. Соберите весь куриный ополаскиватель с отфильтрованной стороны пакета с помощью моторизованного контроллера дозатора (см. Таблицу материалов).
    7. Разлейте куриный ополаскиватель в стерильные центрифужные бутылки. Центрифуга при 10 000 x g в течение 10 мин при комнатной температуре.
    8. Осторожно соберите надосадочную жидкость с помощью моторизованного контроллера дозатора с одноразовой серологической пластиковой пипеткой объемом 25 мл. Не потревожите гранулу.
    9. При необходимости повторите процесс, чтобы убедиться, что вся надосадочная жидкость удалена.
    10. Собранную надосадочную жидкость выбросьте.

2. Селективное обогащение Campylobacter из сырого мяса

  1. Приготовление болтонского бульона с добавками
    1. Растворите 13,8 г порошка (см. таблицу материалов) в 500 мл очищенной воды. Стерилизовать бульон в автоклаве в течение 15 мин при 121 °C.
    2. Добавьте 25 мл лошадиной крови (см. таблицу материалов) к стерилизованному бульону Болтона объемом 500 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление лошадиной крови действует как гаситель кислорода, помогая в восстановлении поврежденных клеток Campylobacter из пищевого матрикса.
    3. Восстановите 1 флакон антибиотика (цефоперазон, циклогексимид, триметоприм и ванкомицин, см. таблицу материалов) в 5 мл 50% этанола.
    4. Добавьте восстановленную добавку с антибиотиком в бульон Болтона.
  2. Процедура обогащения
    1. Повторно суспендируйте гранулу в 50 мл болтонского бульона, содержащего лейкированную лошадиную кровь и антибиотики.
    2. Поместите образцы (с ослабленными крышками) в герметичную емкость, содержащую газовую смесь 85% N2, 10% CO2 и 5% O2.
      1. Убедитесь, что крышка свободна, но контейнер плотно закрыт, чтобы обеспечить микроаэрофильный и термофильный рост Campylobacter.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Газовые пакеты, поддерживающие атмосферу 85% N2, 10% CO2 и 5% O2 , можно использовать, когда климатические камеры недоступны.
      2. Инкубируют образцы при 42 °C в течение 24 ч.

3. Выделение и очистка C. jejuni и C. coli от сырой курицы

  1. Приготовление пластин из агара бруцеллы
    1. Растворите 28 г порошка бруцеллы (см. таблицу материалов) в 1 л очищенной воды. Растворите 15 г агара в растворе бруцеллы.
    2. Стерилизовать агар бруцеллы в автоклаве в течение 15 минут при температуре 121 °C. Охладите смесь среднего агара на водяной бане с температурой 55 °C.
    3. Налейте 20 мл агара бруцеллы в каждую чашку Петри диаметром 100 мм.
  2. Фильтрующий метод и выращивание колоний
    1. Оценивают влияние влаги на кампилобактер, проходящий через фильтры, путем сушки пластин с агаром бруцеллы с открытыми крышками в шкафу биобезопасности в течение 0 ч, 1 ч, 2 ч и 3 ч.
    2. Подготовьте контроль без фильтра, распределив 80 мкл образца непосредственно на пластине с агаром бруцеллы.
  3. Поместите фильтр из ацетата целлюлозы (размером пор 0,45 мкм или 0,65, см. Таблицу материалов) в центр пластины с агаром бруцеллы.
  4. Пипетка 4 капли/фильтр и 20 мкл/капля обогащенного образца на фильтр.
    1. Поместите капли рядом с центром фильтра, чтобы жидкость, достигающая пластины, проходила через фильтр, а не вокруг фильтра.
    2. Размещайте капли таким образом, чтобы они не растекались и не скапливались.
  5. Капли выдерживают при комнатной температуре 15 мин и осторожно снимают фильтры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап дает клеткам Campylobacter достаточно времени, чтобы пройти через мембрану и достичь агаровой среды без чрезмерной сушки.
  6. Инкубируйте планшеты при 42 °C в течение примерно 24 ч в микроаэробных условиях, описанных выше.
  7. Подбирайте характерные колонии Campylobacter с определенными признаками.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Колонии кампилобактеров обычно круглые с гладкими краями, блестящие и полупрозрачного желтоватого или розоватого цвета6.
  8. Нанесите колонии на пластины с агаром бруцеллы для очистки. Повторяйте этот шаг до тех пор, пока не будут получены пластины с одной однородной морфологией колонии.
  9. Подготовьте образцы для длительного хранения.
    1. Приготовьте бульон Болтон, как описано выше. Добавьте одну колонию из пластины с однородной морфологией колонии.
    2. Выращивают в течение ночи (24 ч) в микроаэрофильных условиях, описанных ранее. Добавьте 900 мкл ночного культивирования в 2 мл криовиальной камеры, содержащей 100 мкл ДМСО.
    3. Быстро охладите в ванне с сухим льдом и этанолом (около -72 °C) в течение 10 минут. Переложите в морозильную камеру с температурой -80 °C для длительного хранения.

4. Идентификация видов C. jejuni и C. coli

  1. Провести видовую идентификацию C. jejuni и C. coli с помощью мультиплексного анализа кПЦР (mqPCR), ранее разработанного18,19.
    1. Выполняйте быстрый лизис клеток и экстракцию геномной ДНК в формате 96-луночного планшета.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Настоятельно рекомендуется рассмотреть возможность использования коммерческих наборов (см. Таблицу материалов), чтобы убедиться, что образец в достаточной степени свободен от известных ингибиторов ПЦР.
      1. Диспергировать очищенные колонии Campylobacter в 100 мкл экстракционного раствора.
      2. Лизируйте образцы при 99 °C в течение 10 мин с последующим охлаждением при 20 °C в течение 2 мин в амплификаторе.
      3. Центрифугируйте планшет при 8 000 x g в течение 10 минут при комнатной температуре. Удалить 2 мкл аликвот надосадочной жидкости для анализа mqPCR.
      4. Приготовьте реакционную смесь объемом 20 мкл, состоящую из 10 мкл 2x Master Mix, 2,0 мкл образца ДНК, 104 копий шаблона внутреннего контроля амплификации (IAC) и 200 нМ каждого праймера и зонда (см. таблицу материалов).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Праймеры и зонды hipO и cdtA являются эксклюзивными генами-мишенями для C. jejuni и C. coli соответственно. IAC состоит из 79-.н. сегмента ДНК аденовируса человека и включен в качестве положительного контроля для обеспечения постоянной активности ДНК-полимеразы во всех образцах.
    2. Загрузите все образцы в трех экземплярах в 96-луночную оптическую пластину, покрытую оптической пленкой, и поместите их в систему ПЦР в реальном времени (см. таблицу материалов).
      1. Инициировать горячую активацию ДНК-полимеразы при 95 °C в течение 10 мин. Затем следует 40 циклов денатурации при 95 °C в течение 15 с и отжига/удлинения при 60 °C в течение 1 мин.

5. Перечислите клеточные суспензии

  1. Перечислите клеточные суспензии с помощью процедуры 6 x 6 с откидной пластиной20. В Дополнительном файле 1 приведены изображения, изображающие метод откидной пластины 6 x 6.
  2. Пластины с агаром бруцеллы высушить на воздухе со снятой крышкой в ламинарном колпаке в течение 45 минут.
  3. Добавьте 200 мкл бактериальной суспензии в шесть рядов (A-F) в первом столбце 96-луночного планшета.
  4. Распределите 180 мкл среды бруцеллы по шести рядам оставшихся столбиков (2-12).
  5. Приготовьте десятикратные последовательные разведения, используя перенос 20 мкл.
    1. Например, перенесите 20 мкл образца из первой колонны во вторую. Повторите этот процесс как минимум для 6 столбцов.
    2. Рефлегматор перемешайте каждую суспензию десять раз с помощью пипетки, меняя наконечники между каждым переносом.
  6. С помощью многоканальной пипетки наносите капли объемом 7 мкл из шести рядов колонки на поверхность пластины с агаром бруцеллы.
  7. Повторите эти действия, чтобы создать массив 6 x 6, убедившись, что строки технически повторяются по столбцам.
  8. Высушите пластины на воздухе в течение 5 минут, а затем переверните пластину. Инкубируют планшеты при 42 °C в течение 24 ч.
  9. Подсчитайте количество колоний в каждом репрезентативном разведении.

Representative Results

Влияние влаги в агаровых пластинах Brucella для пассивной фильтрации Campylobacter
Campylobacter имеет небольшой геном и не имеет нескольких генов реакции на стресс, обычно встречающихся у других бактерий, таких как E. coli O157:H7 и сальмонелла. Поэтому он более чувствителен к различным стрессам окружающей среды и не переносит обезвоживание или уровень кислорода в окружающей среде. И наоборот, чрезмерно влажная агаровая среда может затопить фильтр. Это не только вызывает диффузию образца наружу фильтра, но и увеличивает время воздействия кислорода21.

Для определения подходящих условий для фильтрационной изоляции Campylobacter планшеты с агаром Brucella высушивали со снятыми крышками в течение 0 ч, 1 ч, 2 ч и 3 ч в шкафу биологической безопасности и оценивали эффективность клеток Campylobacter при прохождении фильтра размером пор 0,65 мкм. Четыре аликвоты по 20 мкл культур C. jejuni S27 в концентрациях 1,53 x 104 и 1,53 x 105 КОЕ/мл пипетировали на каждую фильтрующую мембрану, которая была помещена поверх пластины бруцеллы. Через 15 минут проникновения фильтры удаляли, а планшеты инкубировали в течение ночи для роста клеток.

Затем подсчитали клетки из 5 реплицированных пластин и отметили в таблице 1. Результаты показали, что агаровые пластины, высушенные в течение 2 ч и 3 ч, работали одинаково с почти равным количеством клеток, извлеченных из пассивной фильтрации. Примечательно, что пластины, высушенные в этих условиях в течение 0 ч и 1 ч, не позволяли клеткам полностью пройти мембрану в течение 15-минутного периода времени.

Сравнение фильтрующих мембран с различными размерами пор для выделения Campylobacter из куриной печени
Учитывая размеры клеток Campylobacter (0,5-5 мкм в длину и 0,2-0,9 мкм в ширину) и широкий диапазон размеров пищевых частиц, фильтры из ацетата целлюлозы с размером пор 0,45 мкм и 0,65 мкм были протестированы на эффективность пассажа Campylobacter при 15-минутном времени инкубации. Для эксперимента использовали образцы пищи, состоящие из 450 г куриной печени, приправленной 153 КОЕ C. jejuni и затем обогащенной в течение ночи. В качестве контроля без фильтра параллельно включалось прямое покрытие образца обогащения. Результаты (рис. 2) на 5 реплицированных планшетах последовательно показали, что фильтр с размером пор 0,65 мкм позволяет пройти больше клеток, чем фильтры размером с пор 0,45 мкм, что приводит к увеличению количества полученных клеток в ~29 раз. Фильтр с размером пор 0,45 мкм удерживал слишком много клеток на верхней стороне фильтра, что приводило к значительно более низкому извлечению кампилобактера из пищи по сравнению с фильтром с размером пор 0,65 мкм. Как и ожидалось, на контрольных пластинах без фильтра росла лужайка из различных фоновых организмов.

Применение пассивной фильтрации в изоляции Campylobacter от розничной курицы
Из-за необычной подвижности клеток Campylobacter был выбран метод пассивной фильтрации для выделения C. jejuni и C. coli из розничных мясных продуктов, которые, как правило, загрязнены многочисленными фоновыми организмами. В период с 2014 по 2023 год в различных местных супермаркетах было собрано в общей сложности 79 упаковок сырого мяса, включая различные части куриного мяса, куриной печени, говяжьей печени и телячьей печени. Из каждой упаковки отбирали 450 г для выделения Campylobacter spp. Благодаря сочетанию селективного обогащения кампилобактера в крови, содержащем бульон Болтона, и пассивной фильтрации клеток через фильтр из ацетата целлюлозы размером 0,65 мкм непосредственно на агаровую пластину бруцеллы, 49 штаммов Campylobacter были успешно выделены из 79 образцов мяса (Таблица 2). На рисунке 3 представлен результат выделения нового штамма Campylobacter из куриной печени. Метод неоднократно доказывал свою чувствительность, специфичность и экономичность.

Идентификация и дифференциация изолятов C. jejuni и C. coli
Для верификации рода и дифференциации видов изолятов Campylobacter , полученных из сырого мяса, использовали мультиплексный кПЦР-анализ, амплифицирующий специфические гены-мишени (hipO и cdtA) для C. jejuni и C. coli, а также внутренний амплификационный контроль (IAC). ИАК был включен в качестве ложноотрицательного показателя при одновременной амплификации нескольких генов. Анализ проводили в 96-луночном формате с быстрым лизисом клеток и экстракцией ДНК с использованием коммерчески доступного реагента (см. таблицу материалов). В таблице 2 обобщены результаты видовой идентификации штаммов C. jejuni и C. coli . В качестве дополнительной проверки результаты полногеномного секвенирования подтвердили вид всех изолятов (данные не показаны).

Figure 1
Рисунок 1: Диаграмма рабочего процесса для выделения и идентификации видов Campylobacter из мяса, продаваемого в розницу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Влияние размера фильтра на восстановление Campylobacter. Результаты показывают, что фильтр 0,65 мкм может восстановить в среднем 900 ± 138 колоний, в то время как фильтр 0,45 мкм восстанавливает 31 ± 7 колоний. Результаты были получены из N = 20 (5 планшетов по 4 капли на планшет), а t-критерий Стьюдента показывает, что средние значения статистически различаются (p < 0,0001). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Выделение Campylobacter путем пассивной фильтрации обогащенных образцов домашней птицы. (A) Изображены четыре капли обогащенного образца по 20 мкл, осажденные на нитроцеллюлозном мембранном фильтре. Изображение было получено в течение 15 минут пассивной фильтрации. (B) Изображена пластина после снятия нитроцеллюлозного фильтра. Четыре пятна показывают, где обогащенный образец пересек мембрану. (C) Изображена пластина после 24-часовой инкубации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Влияние времени высыхания пластин агара бруцеллы на пассивную фильтрацию C. jejuni. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 2: Штаммы C. jejuni и C. coli, выделенные из сырого мяса. За период с 2008 по 2023 год из 79 упаковок мяса по 24 уникальным розничным продуктам было выделено 36 штаммов C. jejuni и 13 штаммов C. coli . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Дополнительный файл 1: Образы в процессах изоляции и перечисления. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Discussion

Значение протокола
C. jejuni и C. coli были двумя основными видами Campylobacter, которые были обнаружены в печени домашней птицы22 и печени животных23,24. В этом исследовании образцы мяса куриных частей (ножки, крылышки и бедра), куриной печени и говяжьей печени были случайным образом собраны в разные периоды времени и из разных розничных магазинов и производителей для выделения Campylobacter spp. Из 49 выделенных штаммов Campylobacter 36 были идентифицированы как C. jejuni и 13 были C. coli, при этом другие виды Campylobacter не были обнаружены, что согласуется с другими сообщениями25.

Анализ основан на спиралевидной морфологии клеток и характерной штопорообразной подвижности Campylobacter spp. Для отделения Campylobacter от смеси фоновых организмов был использован простой, но эффективный метод пассивной фильтрации26,27, который использовал спиралевидную морфологию клеток (длинные, тонкие, 0,2-0,9 на 0,5-5 мкм) и сильную подвижность штопора. Высокая подвижность кампилобактера позволяла клеткам преодолевать мембранные фильтры и перемещаться в благоприятные условия внутри агаровой среды, в то время как другие фоновые микроорганизмы из мясных продуктов не могли пройти через них. Этот метод является относительно недорогим, быстрым и селективным, что делает его пригодным для использования в различных условиях, включая предприятия пищевой промышленности, клинические лаборатории и исследовательские лаборатории.

В одной новаторской статье, которую часто цитируют, говорится, что фильтр 0,45 мкм работал настолько хорошо, что фильтр 0,65 мкм не оценивался28. Результаты настоящего исследования показывают, что фильтр с размером пор 0,65 мкм работал значительно лучше, чем с размером пор 0,45 мкм, что привело к 29-кратному увеличению количества клеток, извлеченных из обогащения. Это важно, поскольку выбранные фильтры не демонстрируют пониженную селективность, как сообщалось ранее29. Кроме того, поскольку известно, что фильтрация значительно снижает количество извлеченного кампилобактера по сравнению с прямым нанесением покрытия30, следовательно, увеличение размера пор улучшает восстановление микроорганизма, что согласуется с ранее опубликованными результатами21. Это важно, потому что все клетки, которые проходили через фильтры, образовывали однородные колонии Campylobacter , что указывает на то, что обоих фильтров было достаточно для предотвращения прохождения другой микрофлоры и частиц пищи. Кроме того, в блок-схеме7 FSIS отмечается возможность получения более длительного результата за счет повторного нанесения изолятов на планшеты Campy-Cefex, содержащие антибиотики. В отличие от этого, протокол, описанный в этой рукописи, который сочетает в себе использование фильтрации и селективного обогащения цефоперазоном, циклогексимидом, триметопримом и ванкомицином, не требует повторного стриптинга.

Применяемый в настоящее время метод согласуется с действующими программами отбора проб и верификации FSIS17. Поскольку уровень контаминации кампилобактером может быть низким (153 КОЕ/450 г курицы), промывку центрифугируют для концентрирования образца в четыре раза, что повышает чувствительность анализа. После концентрирования промывки в 4 раза образцы обогащают в течение 48 ч и проверяют с помощью системы молекулярного обнаружения (MDS) для воспроизведения метода, используемого в лабораториях FSIS (данные не показаны). Примечательно, что описанный метод до сих пор не позволил идентифицировать положительные штаммы в течение 24 часов, которые были обнаружены системой молекулярного обнаружения с использованием 48 часов обогащения (данные не показаны). Наконец, дополнительным преимуществом этого протокола является то, что он может предоставить информацию, относящуюся к видам бактерий, и определить, является ли кампилобактер C.coli, C. jejuni или C. lari, в то время как MDS, принятый в MLG 41.07, может обеспечить только бинарный положительный/отрицательный ответ для кампилобактера.

Критические шаги
Протокол выделения и идентификации кампилобактера требует точности при центрифугировании, фильтрации и молекулярном анализе. Точное разведение, надлежащие условия инкубации и тщательное соблюдение условий анализа кПЦР имеют решающее значение для надежной идентификации видов.

Как микроаэрофильная бактерия, Campylobacter очень хрупка и чувствительна к различным стрессам окружающей среды и требует уникальных привередливых условий для роста 31,32,33. В образцах пищевых продуктов, обычно подвергающихся длительным периодам транспортировки и хранения, многие клетки Campylobacter, возможно, находятся в состоянии покоя или сублетального/смертельного повреждения34,35. Таким образом, важно восстановить стрессовые клетки из их пищевых матриц и вырастить их до более высокой концентрации. На первом этапе процедуры мы использовали отвар Болтона с добавлением лошадиной крови и антибиотиков для селективного обогащения кампилобактера из пищи. Дополнительная кровь служила агентом, гасящим кислород, для преодоления неблагоприятного воздействия свободных радикалов кислорода36. Антибиотики применяли для подавления роста фоновой микрофлоры37.

Чтобы свести к минимуму время воздействия кислорода окружающей среды на Campylobacter , был выбран 15-минутный инкубационный период, позволяющий клеткам пройти через фильтр. Также важную роль в скорости прохождения играла влага пластинки агара Brucella под фильтром. В частности, результаты тестирования агаровых пластин, высушенных в течение 0 ч, 1 ч, 2 ч и 3 ч, показали, что высокое содержание влаги в фильтре препятствует прохождению клеток. Не менее важным является точное размещение фильтров и капель на пластинах и фильтрах, что влияет на успех изоляции клеток.

Возможные подводные камни и ограничения
Представляя собой структурированный подход к выделению и идентификации видов Campylobacter из образцов сырой курицы, следует обратить внимание на несколько ограничений этого протокола. Среди основных подводных камней – внешнее загрязнение, недостаточно просушенные пластины, засорение фильтров, препятствующее движению микробов, попадание микроорганизмов в гранулы, неполная герметизация атмосферной камеры и распространение капель за пределы фильтра.

Недостаточное отделение микроорганизмов от поверхности пищевых продуктов или их удержание в объеме пробы может затруднить их выделение с помощью этого метода. Кроме того, зависимость от подвижности микробов при прохождении через пассивные фильтры представляет собой заметное ограничение; возможно, что фильтрующие мембраны сохранили некоторые менее подвижные штаммы Campylobacter , так как было показано, что фильтры могут снижать эффективность улавливания микробных патогенов в пищевых продуктах38. К другим ограничениям относятся периодический характер процессов центрифугирования и фильтрации, подверженность засорению фильтров и неэффективность диспергирования образующихся гранул, что влияет на точность микробной нагрузки. Эти ограничения в совокупности подчеркивают необходимость осторожности и дополнительных методологий для обеспечения всестороннего анализа, особенно при работе с различными типами образцов или при поиске возможностей высокой пропускной способности.

Рекомендации по устранению неполадок
Чтобы предупредить потенциальные проблемы, сначала убедитесь, что все материалы соответствуют необходимым стандартам качества и не имеют срока годности. Устраняйте неполадки в засоренных фильтрах, потенциально используя дополнительную фильтрацию для удаления любых крупных загрязнений, которые могут ограничивать прохождение кампилобактера через нитроцеллюлозную мембрану. Если наблюдается загрязнение, убедитесь, что капли не были помещены слишком близко к краю фильтра и позволили жидкости достичь агара, обойдя фильтр, а не через поры. Если после обогащения наблюдается недостаточный рост, убедитесь, что уплотнения атмосферных контейнеров герметичны и не протекают.

Потенциальная доработка и расширение
Изучение альтернативных фильтрующих материалов может улучшить микробный обход и позволить расширить этот протокол для использования для выделения других подвижных микроорганизмов из гетерогенных смесей, таких как пищевые продукты. Рекомендуется определить контрольные группы, позволяющие сохранить менее подвижные варианты Campylobacter без негативного влияния на специфичность. Кроме того, несмотря на то, что мультиплексный анализ кПЦР, использованный в этом исследовании, продемонстрировал способность обнаруживать C.lari,в этот анализ могут быть включены 18 других видов Campylobacter , представляющих интерес.

Таким образом, путем оценки различных параметров и настроек были созданы надлежащие условия для изоляции C. jejuni и C. coli на видовом уровне в пищевых продуктах. Было доказано, что метод является чувствительным, специфичным, надежным и экономически эффективным. Применив его к реальным образцам пищевых продуктов, протокол смог выделить 36 штаммов C. jejuni и 13 C. coli из 79 упаковок мяса.

Протокол согласован с Директивой FSIS 10,250.117, в которой описана процедура отбора проб сырых куриных частей, и MLG 41.076 для выделения и идентификации Campylobacter. Полученные данные свидетельствуют о том, что концентрирование образца в 4 раза и обогащение его в течение 24 ч в сочетании с фильтрацией и покрытием позволяет получить изолированные, подтвержденные колонии в течение 48 ч, а не 96 ч. Протокол совместим с методами, основанными на ДНК, такими как секвенирование генома, чтобы обеспечить всестороннюю характеристику штаммов Campylobacter , включая их профили устойчивости к противомикробным препаратам, прогнозы вирулентности и филогенетические отношения. Протокол представляет собой многообещающую альтернативу для эффективного выздоровления и изоляции Campylobacter spp. от сырой птицы, что может способствовать проведению эпидемиологических исследований и вмешательств в области общественного здравоохранения.

Disclosures

Все авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Acknowledgments

Это исследование было поддержано Министерством сельского хозяйства США, Службой сельскохозяйственных исследований (USDA-ARS), Национальная программа 108, номера Current Research Information System 8072-42000-093 и 8072-42000-094-000-D. Упоминание торговых наименований или коммерческих продуктов в этой статье предназначено исключительно для предоставления конкретной информации и не подразумевает рекомендации или одобрения со стороны Министерства сельского хозяйства США. Министерство сельского хозяйства США является поставщиком равных возможностей и работодателем.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar - Solidifying Agent (Difco) Becton, Dickinson and Company (BD) 281230
Analytical Balance Mettler Toledo JL602-G/L Equipment 
Analytical Balance Mettler Toledo AB54-S Equipment 
Antibiotic supplements cefoperazone, cycloheximide, trimethoprim, vancomycin Oxoid Ltd. SR0183E
Atmosphere Control Gas Pak  (Campy, 85% N2, 10% CO2, and 5% O2) Becton, Dickinson and Company (BD) 260680
Atmosphere Control Vessel,  GasPak EZ CampyPak container system  Becton, Dickinson and Company (BD) 260678
Autoclave - Amsco Lab250, Laboratory Steam Sterilizer Steris plc LV-250 Equipment 
Biological Safety Cabinet, Type A2, Purifier Logic+ Labconco Corporation 302411101 Equipment 
Bolton broth  Oxoid Ltd. CM0983
Brucella broth (Difco) Becton, Dickinson and Company (BD) 211088
Buffered Peptone Water Bio-Rad Laboratories Inc. 3564684
Centrifuge Microcentrifuge 5424 Eppendorf 5424 Equipment
Centrifuge, Avanti J-25 Beckman Coulter, Inc.  Equipment
Chicken thighs, wings, drumsticks, livers Local retailers
DNA Extraction - PreMan Ultra Sample Preparation Reagent  Thermo Fisher Scientific Inc.  4318930
FAM probe for hipO (Sequence 5'-TTGCAACCTCACTAGCAAAATCC
ACAGCT-3')		 Integrated DNA Technologies
Filter - 0.45 µm sterile cellulose acetate filter  Merck-Millipore LTD DAWP04700
Filter - 0.65 µm sterile cellulose acetate filter  Merck-Millipore LTD HAWG04700
forward primer for cdtA (Sequence 5'-TGTCAAACAAAAAACACCAAGCT
T-3' ')		 Integrated DNA Technologies
forward primer for hipO (Sequence 5'-TCCAAAATCCTCACTTGCCATT-3') Integrated DNA Technologies
forward primer for IAC (Sequence 5'-GGCGCGCCTAACACATCT-3') Integrated DNA Technologies
HEX probe for cdtA (Sequence 5'-AAAATTTCCCGCCATACCACTTG
TCCC-3')		 Integrated DNA Technologies
Incubator - Inova 4230 refrigerated incubator shaker New Brunswick Scientific 4230 Equipment 
Inoculating Loop - Combi Loop  10µL and 1µL  Fisher Scientific International, Inc 22-363-602
Internal Amplification Control (IAC) DNA fragment (Sequence 5'-TGGAAGCAATGCCAAATGTGTAT
GTGGTGGCATTGTCTTCTCCC
GTTGTAACTATCCACTGAGATG
TGTTAGGCGCGCC-3')		 Integrated DNA Technologies
Laked horse blood  Remel Inc. R54072
Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+ Mettler Toledo 17014382 Equipment
Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-100XLS+ Mettler Toledo 17014384 Equipment
Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+ Mettler Toledo 17014388 Equipment
Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+ Mettler Toledo 17014391 Equipment
Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+ Mettler Toledo 17014392 Equipment
Manual pipette Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+ Mettler Toledo 17013805 Equipment
Manual pipette Pipet-Lite Multi Pipette L8-20XLS+ Mettler Toledo 17013803 Equipment
Media Storage Bottle -PYREX 1 L Square Glass  Bottle, with GL45 Screw Cap Corning Inc. 1396-1L Equipment
Media Storage Bottle -PYREX 2 L Round Wide Mouth Bottle, with GLS80 Screw Cap Corning Inc. 1397-2L Equipment
Microtiter plate, 96 well plate, flat bottom, polystyrene, 0.34 cm2, sterile, 108/cs MilliporeSigma Z707902
Mixer - Vortex Genie 2 Scientific Industries Inc. SI-0236 Equipment
Motorized pipette controller, PIPETBOY2 INTEGRA Biosciences Corp. Equipment
PCR Mastermix 2× TaqMan Gene Expression  Thermo Fisher Scientific Inc.  4369542
Petri Dish Rotator -  bioWORLD Inoculation Turntable Fisher Scientific International, Inc 3489E20 Equipment
Petri Dishes with Clear Lid (100 mm x 15mm) Fisher Scientific International, Inc FB0875713
Pipette Tips GP LTS 1000µL S 768A/8 Mettler Toledo  30389273
Pipette Tips GP LTS 20µL 960A/10 Mettler Toledo 30389270
Pipette Tips GP LTS 200µL F 960A/10 Mettler Toledo 30389276
Reagent Reservoir, 25 mL sterile reservoir used with multichannel pipettors Thermo Fisher Scientific Inc.  8093-11
Realtime PCR - 7500 Real-Time PCR system  (Applied Biosystems, Foster City, CA) Equipment
reverse primer for cdtA (Sequence 5'-CCTTTGACGGCATTATCTCCTT-3') Integrated DNA Technologies
reverse primer for hipO (Sequence 5'-TGCACCAGTGACTATGAATAACG
A-3')		 Integrated DNA Technologies
reverse primer for IAC (Sequence 5'-TGGAAGCAATGCCAAATGTGTA
-3')		 Integrated DNA Technologies
Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (10 mL) Thermo Fisher Scientific Inc.  170356N
Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (2 mL) Thermo Fisher Scientific Inc.  170372N
Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (25 mL) Thermo Fisher Scientific Inc.  170357N
Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (50 mL) Thermo Fisher Scientific Inc.  170376N
Spreader - Fisherbrand L-Shaped Cell Spreaders Fisher Scientific International, Inc 14-665-230
Stomacher bag, Nasco Whirl-Pak Write-On Homogenizer Blender Filter Bags Thermo Fisher Scientific Inc.  01-812
TAMRA probe for IAC (Sequence 5'-TTACAACGGGAGAAGACAATGCC
ACCA-3')		 Integrated DNA Technologies
Thermocycler (GeneAmp PCR system 9700) Applied Biosystems Equipment
Water Filtration - Elga Veolia Purelab Flex  Elga LabWater PF2XXXXM1-US Equipment

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rushton, S. P., et al. Climate, human or environment: Individual-based modelling of Campylobacter seasonality and strategies to reduce disease burden. J Transl Med. 17 (1), 34 (2019).
  2. Facciolà, A., et al. Campylobacter: From microbiology to prevention. J Prev Med Hyg. 58 (2), E79-E92 (2017).
  3. Perez-Arnedo, I., Gonzalez-Fandos, E. Prevalence of Campylobacter spp. In poultry in three spanish farms, a slaughterhouse and a further processing plant. Foods. 8 (3), 111 (2019).
  4. Nachamkin, I., Allos, B. M., Ho, T. Campylobacter species and guillain-barré syndrome. Clin Microbiol Rev. 11 (3), 555-567 (1998).
  5. Department of Food Administration. Bacteriological analytical manual. Department of Food Administration. , (1992).
  6. USDA Office of Public Health Science. Isolating and identifying Campylobacter jejuni/coli/lari from poultry rinsate, sponge and raw product samples. Microbiology Laboratory Guidebook. , (2022).
  7. Singh, H., Rathore, R. S., Singh, S., Cheema, P. S. Comparative analysis of cultural isolation and PCR based assay for detection of Campylobacter jejuni in food and faecal samples. Braz J Microbiol. 42 (1), 181-186 (2011).
  8. Kralik, P., Ricchi, M. A basic guide to real time pcr in microbial diagnostics: Definitions, parameters, and everything. Front Microbiol. 8, (2017).
  9. Linton, D., Lawson, A. J., Owen, R. J., Stanley, J. PCR detection, identification to species level, and fingerprinting of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli direct from diarrheic samples. J Clin Microbiol. 35 (10), 2568-2572 (1997).
  10. Kabiraz, M. P., Majumdar, P. R., Mahmud, M. M. C., Bhowmik, S., Ali, A. Conventional and advanced detection techniques of foodborne pathogens: A comprehensive review. Heliyon. 9 (4), e15482 (2023).
  11. Kaakoush, N. O., Castaño-Rodríguez, N., Mitchell, H. M., Man, S. M. Global epidemiology of Campylobacter infection. Clin Microbiol Rev. 28 (3), 687-720 (2015).
  12. Gilbreath, J. J., Cody, W. L., Merrell, D. S., Hendrixson, D. R. Change is good: Variations in common biological mechanisms in the epsilonproteobacterial genera Campylobacter and Helicobacter. Microbiol Mol Biol Rev. 75 (1), 84-132 (2011).
  13. Lertsethtakarn, P., Ottemann, K. M., Hendrixson, D. R. Motility and chemotaxis in campylobacter and helicobacter. Annu Rev Microbiol. 65, 389-410 (2011).
  14. Jokinen, C. C., et al. An enhanced technique combining pre-enrichment and passive filtration increases the isolation efficiency of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli from water and animal fecal samples. J Microbiol Methods. 91 (3), 506-513 (2012).
  15. Engberg, J., On, S. L., Harrington, C. S., Gerner-Smidt, P. Prevalence of Campylobacter, Arcobacter, Helicobacter, and Sutterella spp. In human fecal samples as estimated by a reevaluation of isolation methods for Campylobacters. J Clin Microbiol. 38 (1), 286-291 (2000).
  16. Lastovica, A. J., Le Roux, E. Efficient isolation of campylobacteria from stools. J Clin Microbiol. 38 (7), 2798-2799 (2000).
  17. USDA. Salmonella and Campylobacter verification program for raw poultry products. FSIS Directive 10250.1. 10000 Series: Laboratory Services. USDA. , (2021).
  18. He, Y., et al. Simultaneous detection and differentiation of Campylobacter jejuni, c. Coli, and c. Lari in chickens using a multiplex real-time PCR assay. Food Anal Methods. 3, 321-329 (2010).
  19. Suo, B., He, Y., Tu, S. -I., Shi, X. A multiplex real-time polymerase chain reaction for simultaneous detection of salmonella spp., escherichia coli o157, and listeria monocytogenes in meat products. Foodborne Pathog Dis. 7 (6), 619-628 (2010).
  20. Chen, C. Y., Nace, G. W., Irwin, P. L. A 6 x 6 drop plate method for simultaneous colony counting and MPN enumeration of Campylobacter jejuni, listeria monocytogenes, and escherichia coli. J Microbiol Methods. 55 (2), 475-479 (2003).
  21. Speegle, L., Miller, M. E., Backert, S., Oyarzabal, O. A. Use of cellulose filters to isolate Campylobacter spp. From naturally contaminated retail broiler meat. J Food Prot. 72 (12), 2592-2596 (2009).
  22. Guirin, G. F., Brusa, V., Adriani, C. D., Leotta, G. A. Prevalence of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli from broilers at conventional and kosher abattoirs and retail stores. Rev Argent Microbiol. 52 (3), 217-220 (2020).
  23. Noormohamed, A., Fakhr, M. K. A higher prevalence rate of Campylobacter in retail beef livers compared to other beef and pork meat cuts. Int J Environ Res Public Health. 10 (5), 2058-2068 (2013).
  24. Walker, L. J., et al. Prevalence of Campylobacter coli and Campylobacter jejuni in retail chicken, beef, lamb, and pork products in three Australian states. J Food Prot. 82 (12), 2126-2134 (2019).
  25. Zhao, C., et al. Prevalence of Campylobacter spp., Escherichia coli, and Salmonella serovars in retail chicken, turkey, pork, and beef from the greater Washington, D.C., area. Appl Environ Microbiol. 67 (12), 5431-5436 (2001).
  26. Honsheng, H., Manuel Mariano, G. Campylobacter. Guillermo, T. -I., Saeed, E. -A. , IntechOpen. Rijeka. (2022).
  27. He, Y., et al. Rapid identification and classification of Campylobacter spp. using laser optical scattering technology. Food Microbiol. 47, 28-35 (2015).
  28. Steele, T. W., Mcdermott, S. N. The use of membrane filters applied directly to the surface of agar plates for the isolation of Campylobacter jejuni from feces. Pathology. 16 (3), 263-265 (1984).
  29. Bourke, B., Chan, V. L., Sherman, P. Campylobacter upsaliensis: Waiting in the wings. Clin Microbiol Rev. 11 (3), 440-449 (1998).
  30. Berrang, M. E., Meinersmann, R. J., Cox, N. A. Passage of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli subtypes through 0.45- and 0.65-micrometer-pore-size nitrocellulose filters. J Food Prot. 80 (12), 2029-2032 (2017).
  31. Hill, G. N., et al. Optimizing enrichment of Campylobacter on poultry. J App Poult Res. 26 (3), 307-315 (2017).
  32. Kim, J. C., Oh, E., Kim, J., Jeon, B. Regulation of oxidative stress resistance in Campylobacter jejuni, a microaerophilic foodborne pathogen. Front Microbiol. 6, 751 (2015).
  33. Nennig, M., et al. Metaphenotypes associated with recurrent genomic lineages of Campylobacter jejuni responsible for human infections in luxembourg. Front Microbiol. 13, (2022).
  34. Moore, J. E. Bacterial dormancy in Campylobacter: Abstract theory or cause for concern. Int J Food Sci Technol. 36 (6), 593-600 (2001).
  35. Saha, S., Saha, S., Sanyal, S. Recovery of injured Campylobacter jejuni cells after animal passage. Appl Environ Microbiol. 57 (11), 3388-3389 (1991).
  36. Baylis, C. L., Macphee, S., Martin, K. W., Humphrey, T. J., Betts, R. P. Comparison of three enrichment media for the isolation of Campylobacter spp. From foods. J Appl Microbiol. 89 (5), 884-891 (2000).
  37. Line, J. E. Development of a selective differential agar for isolation and enumeration of Campylobacter spp. J Food Prot. 64 (11), 1711-1715 (2001).
  38. Armstrong, C. M., et al. Impacts of clarification techniques on sample constituents and pathogen retention. Foods. 8 (12), 636 (2019).

Tags

Биология выпуск 204 Campylobacter концентрация пробы фильтрация выделение детектирование мультиплексная кПЦР перебор клеток
Обнаружение и выделение <i>Campylobacter </i> spp. из сырого мяса
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

He, Y., Capobianco, J., Armstrong,… More

He, Y., Capobianco, J., Armstrong, C. M., Chen, C. Y., Counihan, K., Lee, J., Reed, S., Tilman, S. Detection and Isolation of Campylobacter spp. from Raw Meat . J. Vis. Exp. (204), e66462, doi:10.3791/66462 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter