過渡吸収データの処理、フィッティング、および解釈の紹介

Summary

このプロトコルは、過渡吸収スペクトルの処理、フィッティング、および解釈への初心者の入り口です。このプロトコルの焦点は、データセットの準備と、単一波長動力学とグローバル寿命分析の両方を使用したフィッティングです。過渡吸収データとそのフィッティングに関連する課題について説明します。

Abstract

過渡吸収(TA)分光法は、系の吸収スペクトルの変化を通じて励起状態プロセスの進化を追跡するために使用される強力な時間分解分光法です。TAの初期の実装は専門の研究所に限定されていましたが、商用ターンキーシステムの進化により、世界中の研究グループがTA技術をますます利用できるようになりました。最新のTAシステムは、光物理情報が豊富な高エネルギーおよび時間分解能の大規模なデータセットを生成することができます。しかし、TAスペクトルの処理、フィッティング、解釈は、励起状態の特徴や機器アーチファクトが多数あるため、困難な場合があります。TAデータを収集、処理、およびフィッティングする際には、どのモデルまたはフィッティングパラメータのセットがデータを最もよく表しているかについての不確実性を減らすために、多くの要因を慎重に考慮する必要があります。データの準備とフィッティングの目的は、分析のためにデータを保持しながら、これらの無関係な要因をできるだけ減らすことです。この方法では、TAデータの処理と準備のためのプロトコルと、選択されたフィッティング手順とモデル、特に単一波長フィッティングとグローバル寿命解析の簡単な紹介が初心者に提供されます。データ準備でよく遭遇するいくつかの課題とその対処方法について解説し、その後、これらの単純なフィッティング方法の課題と制限について説明します。

Introduction

過渡吸収(TA)分光法は、光パルスによる励起後の吸収スペクトルの時間依存的な変化を通じて、光励起種の進化を監視する時間分解分光法です。TAは吸収技術であるため、放射遷移(すなわち、通常、光子を放出する状態)と非放射遷移(典型的には非蛍光であり、内部変換、システム間交差、または光反応に関与する状態)の両方を受ける状態から生じる分光信号を識別し、その進化を追跡することができます^1,2.TAは、励起源と検出方法の詳細に応じて、フェムト秒からマイクロ秒を超えて、UVから遠赤外までの速度論へのアクセスを可能にし、汎用性の高い分光ツールにします。TA分光計の商業化は過去数十年で大幅に進歩し、より多くのラボや施設がこの強力な技術にアクセスできるようになりました²。

最新のTAシステムは、高いエネルギー分解能と時間分解能で大規模なデータセットを生成することができます。データセットは通常、励起パルスに対する波長と時間遅延の関数としての透過率または吸光度の差値の2Dマトリックスの形式を取ります。このデータセットは、2 次元のヒート マップまたは 3 次元の地形図として表示できます。これらのデータの解釈は、研究者^{が関心のあるシステムを}最もよく表す近似を生成する際にデータセット全体を含めようと努力するにつれて、より複雑になっています3。

TAは幅広い波長と時間スケールをカバーできますが、このプロトコルは、最も広くアクセス可能な形態^の1つである4、フェムト秒パルスレーザーによって駆動される紫外可視領域での広帯域分光法に焦点を当てています。このような機器の概略^図5,6は、図1に提供される。実験は、レーザーからパルスを取り出し、それを2つのコピーに分割することから始まります。「ポンプ」と呼ばれるパルスの1つのコピーを使用して、サンプルを励起します。光パラメトリック増幅器(OPA)などのデバイスは、典型的には、ポンプパルスを所望の励起波長^5,7に変換するために使用される。「プローブ」と呼ばれるパルスの2番目のコピーは、パルスの移動距離を変えることでポンプとプローブパルスの間の時間遅延を変化させることができる機械的遅延段階に入ります。次に、単一波長プローブパルスは、サファイアまたはフッ化カルシウム(_CaF2^)結晶8を用いて白色光連続体に変換される。白色光パルスは試料を通過し、そのスペクトルは電荷結合素子(CCD)カメラなどの広帯域検出器を使用して測定されます。ポンプの有無にかかわらず、白色光パルスのスペクトルの変化を測定することにより、ポンプによって誘起されるサンプルの吸収スペクトルの変化ΔA(T)を測定できます。関心のある読者は、検出プロセスの詳細について、この有用な^{レビュー9}を参照されたい。

すべての形式のTA分光法において、ΔA(t)スペクトルは、2つのパルス^2,5,9,10間の所定の時間遅延tにおける基底状態の吸収(_プローブ)と励起状態(ポンプ_{+プローブ})の差を取ることによって計算されます。

(1)

_プローブはサンプルの定常状態の吸収スペクトルに相当し、時間に依存しないことに注意してください。実験の時間分解能は、ポンプ_{+プローブ}(t)で捕捉されたポンプとプローブの間の遅延から生じます。これらのデータのシミュレーションを図2Aに示します。

定常状態の吸収スペクトルとは対照的に、TAスペクトルは式1で得られた違いにより、正と負の両方の特徴を持つことができます。正の特徴は、ポンプパルスによって生成された新しい吸収種の結果であり、励起発色団状態、三重項状態、幾何学的再配列、溶媒和効果、または励起状態の^光生成物を表すことができます3。これらの特徴を特定し、それらを化学種に割り当てるための一般的なガイドラインは、ディスカッションで提示されます。負の特徴は、基底状態漂白剤(GSB)または誘導放出(SE)のいずれかから発生する可能性があります(図2B)。GSBは、ポンプパルスの吸収に続く基底状態の集団の損失によるものです。励起状態に昇格した分子は、基底状態と同じ領域に吸収されなくなります。したがって、吸収されるプローブパルスは 少なく なり、式1の差はその領域で負になる可能性があります。GSBは、基底状態吸収と同じスペクトル形状を持つが、符号が逆であるという特徴がある。SE信号は、プローブパルス³によって刺激された励起状態の種からの発光から生じる。これらの種からの発光により、検出器に到達する 光が多く なり、これらの波長での 吸収が少なく なります。SE信号は、種の自然発光スペクトルと同様のスペクトル形状を有するが、負の符号および異なる周波数重み付け¹⁰を有する。

励起状態の種に関する情報に加えて、TAスペクトルには、基礎となるダイナミクスを歪め、吸収帯の割り当てを不明瞭にする可能性のある多くのアーチファクトや無関係な特徴が含まれる可能性があります¹¹。データの準備と分析におけるこれらのアーティファクトの不適切な処理は、データへの不適切な光物理学モデルの適用につながり、その結果、誤解を招く結論につながる可能性があります¹¹。したがって、このプロトコルの最初の部分では、TAデータセットを収集した後に適切に処理する方法に焦点を当てます。このセクションの目的は、TAに不慣れな研究者に、データの厳密な準備と処理に対する直感と理解を深めるのに役立つ一連のガイドラインを提供することです。

データセットが処理された後、さまざまなレベルの複雑さと厳密さでスペクトルをフィッティングおよび解釈するための多数のツールとモデルが利用可能になります¹⁰。このプロトコルの第2セクションの目標は、読者が単一波長フィッティングとグローバル分析をデータに適用し、これらのモデルがデータの記述に適している場合に関するガイダンスを提供することです。Ultrafast systems の Surface Xplorer^12,13 (無料でダウンロードして使用、材料表を参照) など、TA データの準備と処理に使用できる商用ソフトウェアがすぐに利用できるようになりました。Glotaran¹⁴など、学術研究者によって他の無料の代替品がリリースされています。Glotaran は、時間分解分光法および顕微鏡データのグローバルおよびターゲット分析用に開発されたフリーソフトウェアプログラムです。これは、RパッケージTIMP¹⁴のグラフィカルユーザーインターフェース(GUI)として機能します。さらに、ユーザーはPythonなどのプログラミング言語を使用して、分析を実行する独自のコードを記述できます。これらのフィッティングソフトウェアとプログラミングソリューションには、それぞれ重要な貢献をする優れた機能があります。この研究の目的のために、この活動の視覚的要素のために提示できるソフトウェアは1つだけです。各フィッティングソフトウェアの詳細な説明は、この記事の範囲を超えています。

本稿では、(1)TAデータの処理、(2)単一波長動力学と大域解析を用いたTAデータのフィッティング、(3)データの抽出と他のモデルへのフィッティングの手順を順を追って説明します。読者が練習用として使用できるように、代表的なTAデータのセットが含まれています(補足ファイル1 および 補足ファイル2)。このデータは、330 nmで励起され、-5 ps〜5.5 nsの範囲で収集されたエタノール中の1,4-ビス(5-フェニルロキサゾール-2-イル)ベンゼン(POPOP)の165 μMサンプルの測定値です。さらに、エタノールのみを含み、サンプルを含まない「ブランク」サンプルを、同じ実験条件下で-5psから5psの範囲で収集し、フィッティング用のデータの準備に使用しました(ステップ1)。スペクトルは、超高速過渡吸収分光計を使用して収集しました。試料を光路長2mmのキュベットに入れ、絶えず撹拌した。ここで説明する処理およびフィッティングの手順は、*.ufs 形式のデータをフィッティングする Surface Xplorer ソフトウェアに基づいており、ここでは "フィッティング プログラム" と呼びます。他の形式のデータセットを *.ufs ファイルに変換するプログラムが利用可能です¹⁵.このプロトコルの詳細は Surface Xplorer に固有のものですが、以下の手順は、商用または自作のソフトウェア パッケージに一般化できます。さらに、データ処理の結果は、これらの他のソフトウェアパッケージを使用して抽出され、適合させることができます。補足情報ファイル(補足ファイル3)には、フィッティングに関する追加のアドバイスが記載されています。

Protocol

1. フィットのためのデータの準備

1. SAMPLEデータセットをフィットソフトウェアに読み込みます。データは 補足図1のように表示されます。
2. 散乱励起光が実験の光学検出ウィンドウ内に存在する場合は、 散乱光の減算 オプションを使用します(補足図2)。散乱励起光がデータに存在しない場合は、ステップ1.5に進みます。
   注:散乱光は、励起波長が光学窓内にある場合に最も一般的に観察されます。散乱光は、励起波長(または回折次数、またはOPAで生成される波長)で、時間とともに変化しない鋭い負(漂白)の特徴として現れます。
3. [ Surface ]メニューをクリックし、[ Subtract Scattered Light ]オプションをクリックします(補足図2)。新しいウィンドウが表示されます。
4. 新しいウィンドウで、 矢印 ボタンをクリックしてバックグラウンドスペクトルの数を平均に設定します(補足図3)。10 個のスペクトルを使用すると、適切な出発点が得られ、必要に応じて数を調整できます。[ Accept ] をクリックして減算を実行します (手順 1.7 に進みます)。
   注:バックグラウンドスペクトルは、データセットに存在する最初のスペクトルから抽出され、バックグラウンド信号の平均化を提供するために必要な数のバックグラウンドスペクトルを使用して時間的に進みます。ただし、使用しすぎると、目的の信号を含むスペクトルが使用され始めるため、使用しすぎないようにします。タイム ウィンドウ データが長い場合、データのタイム ウィンドウの最後に散乱特徴が現れないことがあります。これは、タイム ウィンドウがカメラの積分時間を超えた場合、または TA 実験の構築方法に基づくその他の理由で発生する可能性があります。これを修正するには、 補足ファイル 3 で概説されているように、時間範囲の設定オプションを使用できます。
5. 光学窓内に散乱光が存在しないデータの場合は、[ サーフェス ]メニューをクリックし、[ 背景の減算 ]オプションをクリックします。
6. 表示されるウィンドウで、右下の「Number of Spectra」の 矢印 ボタンをクリックして平均化し(10を選択)、[ Accept]をクリックします。
   注:このオプションのバックグラウンドスペクトルは、「散乱光の減算」オプションと同じように機能します。10 個のスペクトルから始めると、良好な平均化が得られます。より多くのスペクトルを使用できますが、目的の信号を含むスペクトルを含めないように、使用しすぎないように注意する必要があります。Surface Xplorer のユーザー マニュアルには、「散乱光の減算」と「散乱光の減算」 に適用される補正の違いが説明されています。より基本的な「背景の減算」補正。アーチファクト¹⁶に適切な補正を適用することが重要です。
7. 光学窓のエッジ付近のデータは、プローブスペクトルの形状やサンプルが白色光を吸収しすぎるために、S/N比が非常に低くなる可能性があります。これらの領域のノイズの多いデータは、分析をより困難にします。スペクトルの役に立たない部分を取り除きます。スペクトル(左下のタイル)の 終了波長 をクリックし、新しい値を入力し(補足図4)、 Enterをクリックします。ウィンドウの端にあるノイズの多いデータを除去する波長範囲を選択します。提供されたデータの場合、範囲は340〜680nmです。
8. スペクトル ウィンドウを目的の波長範囲に調整します。[Surface]( 表面) メニューをクリックし、[ Crop ](切り抜き)をクリックします(補足図5)。ポップアップウィンドウが表示されます。
   1. [ OK]をクリックします。[ ファイル ]メニューをクリックし、[ 名前を付けてファイルを保存]をクリックします。次に、[ OK]をクリックします。このデータセットを閉じます。
      注:この関数は波長軸と時間遅延軸の両方に沿ってデータをトリミングし、他のすべてのデータを削除するため、トリミングするときは注意してください。時間遅延ウィンドウに、保持するデータの部分が含まれていることを確認します。また、トリミングされたデータは、生データの表面をバックアップとしてそのまま残すために、適切にラベル付けされた新しいファイルとして保存することを強くお勧めします。
9. fs または ps 時間スケールで収集されたデータの場合、チャープ補正を適用する必要があります。データと同じ実験セットアップで採取した溶媒または基質のみ(サンプルなし)でデータ表面を開きます。このサンプルは、"空白" の実験の実行と呼ばれます。「空白」データ(ステップ1.2からステップ1.8まで)に対して、サンプルデータに対して実行したのと同じ一連のステップを実行します。
   注:このような「ブランク」実験は、サンプルと同じ条件で、時間ウィンドウを短くして(たとえば、~-5psから5ps)、時間ゼロの周りのポイント数を増やすことを強くお勧めします。この「ブランク」分析は、サンプルの種類に応じて溶媒または基質のみで構成する必要があり、チャープ曲率を確立するために使用されます。ここまでの「空白」の準備は、サンプルデータと同じ背景補正とトリミングに従う必要があります。「空白」が実行されなかった場合、チャープ補正はデータセットで直接実行できます。
10. チャープ補正プロセスを開始します。ヒートマップタイル(左上)で、 十字線 をクリックし、垂直線コンポーネントをスペクトルの青い端までドラッグします。スペクトル ウィンドウの開始点付近の青色の波長範囲から開始します。 [Kinetics (キネティクス )] メニューをクリックし、[ Fit Solvent Response (溶媒応答のフィット)] をクリックします。
    注:溶媒の適合応答は、時間ゼロを過ぎてもシグナルを生成しない「ブランク」サンプルでのみ実行する必要があります。この近似関数を、関心のある分子または材料に関するデータを含むデータセットに適用しようとすると、プログラムはIRF(装置応答関数)の代わりにデータを近似しようとします。「ブランク」サンプルの場合、存在する信号は、交差位相変調から生じるコヒーレントなアーチファクトのみである必要があります。交差相変調は、ポンプとプローブのビームが重なり合う場合にのみ発生するため、「溶媒応答の適合」オプションを使用して適合できるチャープ曲率の痕跡を提供します。修正に使用する「空白」が付随しないデータには、手動でポイントを配置する必要があり、 補足ファイル3でより詳細に説明されています。
11. 新しい「溶媒応答の適合」ウィンドウが開きます。フィットボタンをクリックします(補足図6)。近似は、ガウスの 1 次導関数と 2 次導関数を使用して機器応答関数への近似を生成します。[保存]ボタンをクリックし、[x]をクリックして画面を閉じます。
    注:赤い適合線は、時間範囲全体にわたってデータポイント(青い白抜きの四角)とよく一致する必要があり、最も重要なのは、時間ゼロ(0.1〜2.0 ps)付近で見られる大きな特徴です。時間ゼロの周囲に多数の点がある場合、近似が最も成功し、これは「空白」実験に短い時間遅延ウィンドウを使用し、多数の点を保持することで実現できます。近似がデータポイントとうまく一致していないと思われる場合は、[ガウス(R0)の追加]チェックボックスをオンにして、近似を再試行します。このオプションは、ガウスの合計を 1 次導関数と 2 次導関数に追加し、この波長での IRF 特徴形状によりよく適合する場合があります。それでも溶媒応答フィッティングで IRF シグナルを捕捉できない場合は、別の波長を選択してください。
12. このプロセス(手順1.10-1.11)を少なくとも5回実行します、チャープを適切に補正するには5つのポイントが必要になるためです。可能であれば、ポイントはスペクトル ウィンドウ全体にわたって間隔を空ける必要があります。一部の溶媒/基質は、実験条件によっては、スペクトルウィンドウの一部で観測可能なシグナルを生成しない場合があります。必要に応じて、許容できるフィット感を得るために、さらにポイントを追加/使用できます。完了したら、「空白」のデータセットを閉じます。
    注: 保存された各ポイントは、ユーザーが [保存] をクリックするとすぐに、作業フォルダー内の Excel ファイルに新しい行として書き込まれます。不要なポイントを保存した場合は、不要なポイントの行を削除することで、そのポイントをExcelファイルから削除できます。
13. トリミングされ、背景から差し引かれたデータセットを再度開きます。[ サーフェス ]メニューをクリックし、[ チャープ補正 ]オプションをクリックします。これにより、3つのウィンドウと右下にメニューがある新しい画面が表示されます(補足図7)。
14. 先ほど作成したチャープ補正を追加します。[ ファイルから追加 ]オプションをクリックし、[フィット係数]で終わるExcelファイルを選択して、[ OK]をクリックします。チャープ補正の近似は、左上のウィンドウにXマーカー付きの黒い線で表示されます(補足図8)。
    注:チャープ補正は実線で表示されます。線に沿ったXマーカーは、溶媒応答プロセスから生成されたポイントです。ポイントを手動で追加するには、十字線を調整して [追加]をクリックします。ポイントをハイライト表示して [削除]を押すことでも削除できます。その他のポイントは、右下のリストに値を入力して手動で編集できます。最後に、必要に応じて、現在の補正をファイルとして保存し、[ ファイルに保存 ]ボタンを使用して後で再利用することもできます。
15. チャー プ補正のプレビュー ボタンをクリックします。これにより、チャープ補正が一時的に適用されます。左上のウィンドウで補正を観察し、データが時間的に平坦化され、曲率が観測されていないことを確認します。
    1. チャープ補正に満足したら、 Apply & Exit ボタンをクリックします。満足できない場合は、手順1.10〜1.14を繰り返し、満足のいく補正が得られるまで、チャープ補正フィットにより多くの(または異なる)波長を選択します。
       注:チャープ補正を適用すると、プレビューに表示される直線に時間ゼロが調整されます。"空白" とデータ サーフェイスの間に時間的なずれがある可能性があります。
16. [ ファイル ]メニューをクリックし、[ 名前を付けてファイルを保存]をクリックします。チャープ補正が適用されたことを示すファイルの名前を入力します。次に、[ OK]をクリックします。
17. データ内の一部の散乱特徴は、バックグラウンド減算を実行するときに完全には除去されない場合があります。これらの特徴はフィットに影響を与え、誤ったフィット結果を生成します。データ内で削除する必要があるフィーチャを見つけます。散乱の特徴は、負の時間領域で最も簡単に識別できます。
    1. 左上のヒート マップ タイルで、 十字線 をクリックして負の時間領域にドラッグします。負の時間領域内にとどまり、十字線を使用して、散乱特徴が開始および終了する波長を決定します。散乱特徴の波長範囲に注意してください(提供されたデータセットの場合、特徴範囲は654 nmから672 nmです)。
       注: フィーチャを削除する必要があるかどうかを判断するときは、水平方向の十字線を時間軸に沿って上下にドラッグして、フィーチャのスペクトル範囲を視覚化します。散乱特徴は通常、非常にノイズの多い単一波長のキネティックトレースを持つため、フィーチャのスペクトル範囲もキネティックトレースを使用して検証できます。
18. 低い波長 (青) から開始して、スペクトル (左下のタイル) の 右端の波長 をクリックし、低い波長 (青) の特徴範囲の値を入力します。
19. [ サーフェス ]メニューをクリックしてデータをトリミングし、[ トリミング]をクリックします。ポップアップメニューの[ OK ]をクリックします。トリミングしたデータを一意のファイル名で保存し、データのどちら側であるかを示します (青または左を推奨)。ファイルを閉じます。
20. 手順1.16で保存したチャープ補正を適用したファイルを開きます。フィーチャの波長範囲が高くなる (赤) まで進みます。スペクトルの 左端 の波長 (左下のタイル) をクリックし、フィーチャの大きい方の範囲の値を入力します。
21. [ サーフェス ]メニューをクリックしてデータをトリミングし、[ トリミング]をクリックします。ポップアップメニューの[ OK ]をクリックします。切り抜いたデータを一意のファイル名で保存し、データのどちら側であるかを示します(赤または右を推奨)。
22. [ ファイル ]メニューをクリックして2つのファイルを結合し、[ 複数のサーフェスを結合]をクリックします。新しいウィンドウで、データの両側(つまり、右と左または青と赤)を選択します。 ctrl + クリック を使用して、各ファイルを選択します。「ファイル名:」ボックスで両方のファイルが選択されていることを確認し、右下の「 OK」をクリックします。プログレスバーが終了すると、データが結合されます。
    注: この方法では、任意の数のファイルを組み合わせることができます。データは、時間軸と波長軸の両方で複数のカットでつなぎ合わせることができます。
23. [ ファイル ]メニューをクリックし、[ 名前を付けてファイルを保存 ]をクリックして、結合されたことを示す一意のファイル名を選択します(結合または複合を推奨)。次に、「 OK 」をクリックしてファイルを保存します。
    注: 後で表示および印刷するために生データ ウィンドウからデータを保存する方法については、セクション 3 を参照してください。ヒート マップ (左上のタイル) のデータは 図 3 のように表示され、適合する準備が整いました。 図 3 に示すように、代表的なスペクトルを可視化する方法は、ステップ 3.1.2 で説明します。

2. フィットの実行

1. 適切に準備されたデータ サーフェイスを読み込みます。
2. 実行するフィッティングを決定し、適切なセクションに移動します。
   注:このプロトコルには、ステップ2.3で単一波長キネティックトレースフィッティング、ステップ2.4でグローバル解析フィッティングの2つのデータフィッティングオプションがあります。
3. 単一波長フィッティング
   1. シングルキネティックフィットを設定するには、カーソル(左上または左下のタイル)を目的の波長に移動します。 キネティクス メニューをクリックし、 次にキネティックのフィットをクリックします。提供されたデータセットでは、632 nm から開始します。
   2. 開いた新しいウィンドウ(補足図9)で、メインフィッティングパラメータとシード値がウィンドウの左上の「current fit @ wavelength」テキストの下のこの領域の隣のボックスのプログラムロゴの下に設定されていることを確認します。
   3. 矢印ボタンをクリックして、[有限のライフタイム]ボックスのライフタイム数(つまり、データのフィットに使用される指数関数的減衰の数)を調整します。指定されたデータセットで、[2 lifetimes] を選択します。開始点として、1 から 3 のライフタイムが一般的です。
   4. データ信号が収集された時間枠を超えて拡張される場合は、「無限」のライフタイムコンポーネントを含める必要があります。これを行うには、[ 無限の有効期間を使用する ]チェックボックスをクリックします。データがベースラインまで完全に減衰する場合は、このチェックボックスをオンにしないでください。指定されたデータセットでは、チェックボックスをオフにしてください。
      メモ : 「無限ライフタイム」では、信号オフセットを維持できます (つまり、プログラムはフィットをベースラインまで減衰させません)。無限成分の使用は、その波長の信号が実験の時間範囲内にベースラインまで減衰しない場合に必要です。
   5. 寿命と関連する振幅、装置の応答時間、および時間ゼロの推定値を入力して、フィッティングプロセスに役立てます(補足図10)。目的のパラメータをクリックします。値ウィンドウ内をクリックし、推定値を入力してから、 初期推定 ボタンをクリックして値を設定します。提供されたデータセットの場合、適切な推定値は、0 = 0 ps、IRF = 0.25 ps、A1 = 0.6、t1 = 100 ps、A2 = 0.08、t2 = 1100 ps です。
      注:「0」は時間ゼロの推定値、「IRF」は計測器の応答時間、「A」は特定の指数関数の振幅(式3を参照)、「t」は寿命/時定数です。適切な推定値を指定すると、プログラムが妥当な適合値を得るのに役立ちます。データセットの A 範囲の値内にある "A" 値を選択します。キネティックトレースで大きな変化が観察される時間範囲で「t」値を選択します。推定値が近似にどのように影響するかを直感的に理解する最良の方法は、いくつかの推定値セットを試して、それらが生成する近似を観察することです。これらのパラメータの1つ以上がわかっている場合は、そのパラメータを設定して「固定」し、近似によって変化しないようにすることができます(補足図11)。
   6. すべての推定パラメータを入力したら、 フィット ボタンをクリックします。代表的な近似を 図 4 に示します。
      注: 近似を適用すると、データプロットに近似線と残差プロットが入力され、近似の品質を評価するために使用できます。寿命と関連する振幅、時間ゼロ、装置応答時間などの近似パラメータも左上のボックスに入力されます。いくつかの異なる近似パラメータを使用して、有効期間の数と、データに最適な「無限」の時間成分を含める/除外するかどうかを決定します。
   7. Saveボタンをクリックしてフィットを保存します(補足図9)。
      注: 後で表示および印刷するために生データ ウィンドウからデータを保存する方法については、セクション 3 を参照してください。
4. グローバル解析のフィッティング
   1. Surfaceメニューをクリックし、Principal Components via SVDオプションをクリックします。新しいウィンドウが表示されます(補足図12)。
      注:右上のウィンドウには主要な動力学トレースが表示され、左下には主要なスペクトルが表示されます。左上のタイルには、元のサーフェスと選択した主成分によって作成されたサーフェスの差によって作成された残差サーフェスの プロットが表示されます。
   2. 矢印ボタンをクリックして「主成分数」を設定します(補足図12)。指定されたデータセットで [15] を選択します。
      注: 選択する主成分の数を決定する場合、1 つの方法は、主スペクトルと主動力学トレースの両方がノイズ パターンに似るまで数を増やし続けることです。選択する主成分の数を決定する別の方法は、右上のタイルの凡例の左側に表示される重み係数の値を確認することです。この値が 0.01 に達するまで主成分の追加を続けます。一般的には、念のため、これ以外にもいくつか追加することをお勧めします。これにより、15個以上の主成分が選択される可能性があります。
   3. [ 保存 ]ボタンをクリックします。保存された主成分は、次のステップに進むために必要です。
      注: 各主成分は、元のデータ サーフェスの複雑さを軽減した表現です。主成分を使用すると、分析対象の生データと比較してサーフェスが単純化されます。データ サーフェスの主要な特徴量のほとんどを考慮することは、正確な適合を得るために非常に重要であるため、それらの特徴をキャプチャするのに十分な主成分を使用することが重要です。より多くの主成分を使用しても、適合度が損なわれることはありません。したがって、選択する主成分の数に疑問がある場合は、主成分を少なくするのではなく、多く使用します。使用しすぎると、フィッティングソフトウェアの動作が遅くなる可能性があることに注意してください。
   4. 主成分を保存すると、プログラムはメイン画面に戻り、グローバルフィットを試みることができます。 Surface(サーフェス )メニューをクリックし、 Global Fit(グローバルフィット )オプションをクリックします。新しいウィンドウが開きます(補足図13)。
      注: 主動線トレースは、右上のタイルに表示されます。左上のタイルには、未加工のサーフェスと比較して、フィットサーフェスのサーフェスが表示されます。左下のタイルには、近似によって生成された減衰関連差分スペクトル (DADS) が表示されます。最後に、右下のタイルは、使用する指数関数の数や無限関数を使用するかどうかなど、フィットパラメータを設定できる場所です。
   5. 「経験値の数」の横の 矢印 ボタンを使用して、近似に含める指数関数の数を設定します。データ信号が収集された時間枠を超えて拡張される場合は、「無限」のライフタイムコンポーネントを含める必要があります。これを行うには、[ オフセットを使用(Ainf) ]チェックボックスをクリックします。指定されたデータセットに対して [2] を選択し、ボックスはクリックしません。データがベースラインまで完全に減衰する場合は、このチェックボックスをオンにしないでください。
      注: フィットパラメータは、フィットを実行する前に、グローバルフィット係数の下の右下のボックスのラベル列をクリックすることで修正できます。ラベルが赤に変わり、ラベルに(固定の)インジケーターが表示されます。右側のボックスに入力された値は、フィットのために自由に変化するのではなく、そのパラメータに使用されます。近似の値を固定するときは、近似の結果に偏りが生じる可能性があるため、注意が必要です。
   6. [ フィット ]ボタンをクリックします。フィットの進行状況は、画面中央の小さなローディングバーに表示されます。フィットの進行が完了すると、ウィンドウにフィットのデータが入力されます(図5 および 補足図14)。フィット結果を視覚的に調べます。
      注: 主キネティック近似と DADS の両方からの情報を使用して、近似を保存する価値があるか、貧弱すぎるかを判断します。一般に、主トレースの適合値がデータとよく一致し、 プロットに特徴がない、またはほとんどない場合、その適合は受け入れられます。寿命の数を変更したり、「オフセットを使用(Ainf)」ボタンのチェック/オフを押すことで、複数のはめあいを簡単にチェックできます。フィットパラメータの複数のバリエーションをチェックした後に生成されたベストフィットは、受け入れられるべきです。
   7. [ 保存 ]ボタンをクリックします。これにより、現在表示されている近似がデータとともにExcelファイルに保存されます。
      注: Excel ファイルは、データセットと同じファイルの場所に保存されます。追加のフィットが実行され、保存する必要がある場合は、以前のバージョンが上書きされます。そのため、新しい近似を生成して保存する前に、古い近似に一意の名前を付けます。近似から保存されるパラメータには、時間ゼロ、IRF、ライフタイム、およびそれらに付随するDADSのみが含まれます。このファイルには、 プロットや主動力学トレースへの近似に関する情報は含まれていません。主動力学トレースの保存については、手順 3.3 で概説します。後で表示およびプロットするために生データウィンドウからデータを保存する方法については、手順3.0を参照してください。

3. プロットのためのフィットソフトウェアからの生データとフィットの抽出

注: 単一波長フィッティングまたはグローバル解析から生成された生データまたはフィットは、他のさまざまなプログラムで開くことができるcsvファイルにエクスポートできます。

1. プロット用の生データの抽出
   1. データセットのヒートマップをエクスポートするには、[ ファイル ]メニューをクリックし、[ CSVにエクスポート ]をクリックします(補足図15)。これによりウィンドウが開き、[ OK ]をクリックして、データファイルと同じ名前で開いているデータファイルと同じディレクトリにcsvファイルを保存します。
      注:または、ヒートマップウィンドウを右クリックし、[ データをクリップボードにエクスポート]をクリックして、生データをエクスポートすることもできます。これにより、データが一時的に保存され、ユーザーが選択したソフトウェアドキュメントに貼り付けることができます。データをExcelファイルに貼り付けて、データを保存します。
   2. 複数のスペクトルは、比較のために、または図を作成する目的でウィンドウに表示してもよい。 水平カーソル (ヒートマップの左上)を目的の時点までドラッグします。 Ctrl + S を押してスペクトルを選択し、スペクトルウィンドウ(左下)に保存します。 図3に示すように、データの進行(5〜10スペクトル)を示すために必要な数の時点を追加します。
      注:データを表すために選択されるスペクトルの数とこれらのスペクトルの時間的配置は、特定のサンプルおよび実験条件に大きく依存する場合があります。上記の推奨事項は一般的なガイドラインですが、実験の詳細によって、データセットのどの部分を強調するかが決まる必要があります。
   3. スペクトルを含むウィンドウを右クリックして、データとしてエクスポートします。クリックしてください クリップボードにデータをエクスポート オプション。データは一時的に保存されます。このデータを目的のソフトウェアドキュメント(Excelなど)に貼り付けて保存します。
   4. 複数のキネティックトレースは、スペクトルウィンドウと同じ方法でキネティクスウィンドウに表示できます。 垂直カーソル (ヒートマップの左上)を目的の波長までドラッグします。 Ctrl + X を押してタイムトレースを選択し、キネティクスウィンドウ(右上)に保存します。必要な数の時点を追加します。これにより、現在のキネティックトレースがウィンドウに一時的に保存されます。
   5. キネティックトレースを含むウィンドウを右クリックして、データとしてエクスポートします。クリックしてください クリップボードにデータをエクスポート オプション。データは一時的に保存されます。このデータを目的のソフトウェアドキュメント(Excelなど)に貼り付けて保存します。
2. 単一波長フィッティングからデータを抽出して表示
   1. Kineticsメニューをクリックし、次にFit Kineticをクリックして、フィットデータを含むウィンドウを開きます。
   2. フィットウィンドウ(つまり、シングルフィットウィンドウの中央のタイル)を右クリックします。[Export Data to Clipboard] をクリックします。これにより、別のソフトウェアプログラムに貼り付けることができるように、一時的に保存されます。
      注: フィットデータの下の残差プロットはエクスポートできず、代わりにフィットデータから再作成する必要があります。近似では、生データと近似線の両方がエクスポートされ、残差の再作成に使用できます。残差は、各時点でデータから適合値を減算し、「適合速度論」ウィンドウに表示されるものと同様のプロットを作成することによって作成されます。
   3. このデータを目的のソフトウェアドキュメント(Excelなど)に貼り付けて保存します。
      注: クリップボードへのエクスポートには、近似で使用される各指数の生データと近似線データのみが含まれます。寿命や振幅などのフィットのパラメータは含まれず、フィットソフトウェアから値をコピーしてエクスポートする必要があります。
3. 表示および解析のためのグローバル寿命解析からのデータの抽出
   1. Surfaceメニューをクリックし、Global Fitオプションをクリックして、フィットデータを含むウィンドウを開きます。
   2. 光学濃度と時間遅延/波長軸の両方の値の精度は、主成分(右上のタイル)とDADS(左下のタイル)でそれぞれ調整する必要があります。右下に設定ボックスが表示されるまで、主成分ウィンドウの上にマウスを置きます。
   3. x.xxボタンをすばやくクリックし、「精度」の上にマウスを置き、メニューから6をクリックして、含める小数点以下の桁数を設定します。
   4. 右下に設定ボックスが表示されるまで、主成分ウィンドウの上にマウスを置きます。 y.yy ボタンをすばやくクリックし、「精度」にマウスオーバーし、メニューから 6 をクリックして、含める小数点以下の桁数を設定します。
   5. Principal Kinetic Tracesウィンドウを右クリックします。[Export Data to Clipboard] をクリックします。これにより、別のソフトウェアプログラムに貼り付けることができるように、一時的に保存されます。
   6. このデータを目的のソフトウェアドキュメント(Excelなど)に貼り付けて保存します。
      注: データは、最初に遅延時間、次に主運動トレース、その後にフィット線を含む一連の列として保存されます。グローバル分析の準備時に選択した主成分ごとに 1 つのセットがあります。DADSスペクトルは、ステップ2.4.7のフィッティング手順の一部としてすでに保存されています。

Representative Results

エタノール中の1,4-ビス[2-(5-フェニルロキサゾリル)]ベンゼン、POPOPの試料の調製および分析は、上記の手順に従って行った。測定は、 図1に示すように、超高速過渡吸収分光計を使用して実施し、調整可能なキュベットホルダーとマグネチックスターラーを使用して、2mmキュベットに流体溶液を入れて混合を確保しました。サンプルは、温度や雰囲気の追加制御なしで、周囲条件で測定しました。340nm〜680nmの光学窓は、フッ化カルシウム結晶を用いて作製した。-5 ps から ~5500 ps の間で 250 の時点を収集し、3 回のスキャンを平均して最終的なデータセットを生成しました ( 図 3)。POPOPデータは、プロトコルに記述されているように準備されました。次善のチャープ補正の例を 補足図16に示します。POPOPで単一波長キネティックフィッティングを行い、対象波長として632nmを選択しました。さらに、プロトコルに記載されているように、POPOPでグローバル分析を実施しました。

632 nmでのPOPOPの単一波長キネティックフィッティングにより、2つの寿命が得られました。これらの寿命は変更可能であり、それ以上の調整は行われませんでした。得られた最終的なパラメータは、t0 = −0.1176 ps、IRF = 0.436 ps、A1 = 0.0956、t1 = 1.614 ps、A2 = 0.0646、t2 = 522.2 psでした(図4)。これらの結果は、その後に実施された全球解析とよく一致しており、報告されたPOPOPの放射寿命値(τ = 1.35 ns)¹⁷。寿命成分が少なすぎる単一波長フィッティングの例を補足 図16に示し、説明します。

POPOPのグローバル解析フィッティングは、SVD実行時に15個の主成分(PC)を選択した上で行いました。フィット後に2つの寿命が選択され、パラメータは固定されませんでした。フィッティングから得られた最終的なパラメータは、t0 = −0.1586 ps、tp (IRF) = 0.4408 ps、t1 = 1459 ps、t2 = 267.5 ps でした。減衰に伴う差分スペクトルを 図5に示します。結果は、632 nmでのシングルキネティックフィッティングの結果およびPOPOP¹⁷の寿命値とよく一致しました。次善大域解析の 2 つの例を 補足図 16 に示し、説明します。

図1:このプロトコルで記述されているフェムト秒広帯域過渡吸収装置の概略図。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図2:TASデータのシミュレーションとTAS信号への寄与。 (A)基底状態吸収スペクトル(青色の点線)と励起状態スペクトル(赤色の点線、基底状態スペクトルから赤方偏移)をシミュレートしたガウス曲線。これら2つのスペクトルの差分スペクトル(紫色、実線)は、TAで見た差分スペクトルです。基底状態と励起状態のスペクトルの違いは、説明のために誇張されています。(B)330 nmで励起した後の1.04 psにおけるPOPOPの代表的なTA差分スペクトル。点線はPOPOPの基底吸光度と定常発光を示す。強調表示された領域は、このデータ内で観察された共通のTA特徴、基底状態漂白剤(GSB)、誘導放出(SE)、および励起状態吸光度(ESA)を示しています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図3:ステップ1-データの準備の適用の結果としてPOPOP用に準備されたデータ。 データは、補正されたヒートマップと代表的なスペクトルとして表示されます。これらの結果は、補正が適用され、データセットにフィットを適用する準備が整った後のデータがどのように表示されるかを示しています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図4:ステップ2.3 - 単一波長フィッティングを適用した後の632 nmでのPOPOPの単一波長フィッティングの結果。 図は、(上のセクション)表形式で得られた寿命、(中央のセクション)はデータ(青い点)とデータへのフィット(赤いフィット線)、(下のセクション)は残差プロットを示しています。「電流フィット」セクションの下には、振幅(A)が、t0における特定の寿命成分の寄与を表すデータからのΔA値として示されていることに注意してください。ただし、現在の近似が保存され、「近似係数」テーブルに表示される場合、デフォルト設定では正規化された振幅が表示されます。この設定は、「Fit Coefficients」ラベル「Normalized」の横のボックスのチェックを外すことで変更できます。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図5:ステップ2.4フィッティング後に得られたPOPOPのグローバル解析フィッティングの結果。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図6:実験TAデータで観察された誘導ラマン散乱の例。 このデータセット(チュートリアルで示したPOPOPデータではありません)では、サンプルは550 nmで励起されました(点線で示しています)。ラマン散乱は時間ゼロ付近で見られ、一般にポンプ励起波長の青(反ストークスラマン散乱)と赤(ストークスラマン散乱)の両方に現れます。誘導ラマン散乱は短命で、通常は約 ~200 fs しかありませんが、これはプローブビームがポンプビームと同時にサンプルと相互作用し、それによってラマンプロセスを刺激する結果として発生するためです。ただし、この機能は避けることができないため、トリミングして削除する必要があります。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

補足図1:データが最初にロードされたときのメインメニュー。 通常、このフィッティングソフトウェアには、ウィンドウにマウスオーバーすると、ウィンドウの右下隅に表示されるオプションボックスがあります。これらのボックスを使用すると、選択したウィンドウの選択範囲の移動、ズーム、パンなど、ウィンドウとのカーソル操作を変更できます。また、ウィンドウの x 軸と y 軸の両方のスケールの精度を調整したり、表示を線形から対数に切り替えたりするためのオプションもあります。軸はロックまたはロック解除することもできます。ロックされている間、軸は指定されたズームレベルまたは値の範囲にとどまります。ロックを解除すると、範囲が切り替わり、データの完全なセットが含まれます。その他のオプションでは、数値の表示やグリッドの色付け(存在する場合)を調整できます。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図2:散乱光減算を実行するための表面メニュー。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図3:散乱光スクリーンの減算 - スペクトルを平均に設定します。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図4:トリミング範囲の設定このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図5:トリミングデータセット。 トリミングされたデータは完全に削除されます。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図6:溶媒応答ウィンドウのフィットと溶媒応答のフィット例(赤線)をデータ(青い点)に表示。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図7:「空白」のサンプルデータを含むチャープ補正ウィンドウ。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図8:チャープ補正をデータセットとともに表示。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図9:シングルキネティックフィットウィンドウ。 さらに、上部のスライダーを使用すると、ユーザーはフィットを実行する波長を選択できます。適切な波長を選択するには、目的のプロセスが発生する場所を特定するためのシステムの分光法に関する知識が必要です。例としては、電荷移動生成物、三重項形成、光生成物形成などがあり、そのスペクトル特性は特定の波長と相関することが知られています。これらの特定の波長は、それらの特定のイベントの寿命を得るために適合させることができます。さらに、選択した波長を使用して、選択したグローバルフィットモデルに検証を提供できます。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図10:シングルキネティックフィットパラメータの設定 個々の近似パラメータは、必要に応じて手動で修正または変更して、近似を微調整し、残差の標準偏差を最小限に抑えることができます。注:パラメータは、ボックス内の値をクリックしてから、スライダーを使用するか、手動で値を入力することで簡単に調整できます。表示されるフィッティングは、値が変更されるとリアルタイムで調整されます。許容できるフィットが得られたら、フィット画面を右クリックしてフィットをエクスポートし、データをクリップボードにエクスポートして目的のプログラムに貼り付けたり、画像としてすばやく表示したりできます。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図11:Single Kinetic Fitパラメータの制約と固定は、1つ以上のパラメータが既知の場合に実行できます。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図12:主成分が十分に追加されたときにトレースと成分がどのように見えるかを示す主成分を含む単一値分解ウィンドウ。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図13:グローバル解析フィットが生成される前のグローバルフィットウィンドウ。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図14:グローバル分析フィットの結果を示すグローバルフィットウィンドウ。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図15:ファイルを保存およびエクスポートするためのファイルメニュー。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図16:最適でないチャープ補正とフィッティングの例。 (A)は、シングルキネティックフィットが悪いことを示しています。パネルAに示されている構造化残差のタイプは、通常、データを適合させるために追加のライフタイムが必要であることを示しています。残差は、短い時間ではゼロを下回り、寿命が長いほどゼロ線より上に上昇することに注意してください。(B) は、プレビュー ボタンを使用して、フィーチャが直線化され、データに曲率が存在しない正しいチャープ補正を示しています。(C)は、スペクトルの青色の部分に顕著な湾曲が存在する誤ったチャープ補正を示しており、チャープ関数がこの領域で過剰に補正されていることを示しています。(D)は、オーバーフィット(パラメータが多すぎる)により、本質的に互いに打ち消し合う類似のライフタイム範囲の「対称的な」DAD(x軸全体で互いの鏡像のように見える)が生成される、貧弱なグローバルライフタイム分析の適合を示しています。これらの特徴が観察される場合は、近似を使用しないでください。(E)は、パラメータが多すぎると寿命が非常に短く、振幅が非常に大きいという、グローバルフィットが不十分であることを示しています。(E)に存在する問題は、時間ゼロ付近のアーチファクトが適切に修正されず、フィッティングが非常に短い寿命(物理的に意味のない寿命)を過度に強調して残差を最小限に抑えることに重点が置かれた場合にも発生する可能性があります。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図17:ラマン散乱によるTASデータの例。 散乱は時間ゼロ付近に存在し、ポンプの励起波長と一致します。散乱は、ポンプ励起の非常に強い正のピーク青と負のピーク赤の一連の鋭いピークで構成されています。この特徴は合理的に防ぐことができないため、フィット結果に干渉しないようにデータから切り取る必要があります。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル 1: このチュートリアルのデータセット (POPOP data_POPOP-inEtOH.ufs) を含むファイル。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル 2: このチュートリアル用の空のデータセット (POPOP data_BLANK.ufs) を含むファイル。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル3:溶媒応答のフィッティング、スキャットの補正、およびサーフェスの減算に関する追加のコメントを含むサポート情報ファイル。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

Discussion

データ準備に関する一般的な考慮事項
TAデータのフィッティングは、一見すると比較的簡単そうに見えるかもしれませんが、特定のデータセットに対して1つの明確な正解が得られることが期待されるかもしれません。しかし、プロトコルで強調されているように、データ収集、データ準備、およびデータ分析には、どのモデルまたはフィッティングパラメータのセットがデータを最もよく表しているかについて不確実性につながる可能性のある、慎重に検討すべき多くの要因があります。データの準備とフィッティングの目的は、分析のためにデータを保持しながら、これらの無関係な要因をできるだけ多く減らすことです。目の前のタスクは、考慮すべきことがたくさんあるため、初心者にとっては気が遠くなるように思えるかもしれません。フィッティングプロセスに関する直感を養うために、初心者は、同じデータをゼロから少し異なる方法で複数回準備してみて、データ準備ステップが最適なフィットにどの程度劇的に影響するかを確認することをお勧めします。さらに、2人の異なる研究者が同じデータを準備して適合させ、結果を比較することができます。このプロセスは、最初の数回は時間がかかるかもしれませんが、そうすることで、初心者は将来のサンプルのために一貫してデータを準備する方法についての直感を養うことができます。他のスキルと同様に、このデータの準備とフィッティングの開発には時間がかかるため、初心者はプロセスを実験して学習する際に忍耐強く規律を保つことをお勧めします。この研究で使用したデータセットは、初心者がチュートリアルと直接合わせ、チュートリアルで生成された結果と直接比較する機会を提供するために提供されています。

データには、ポンプビームの散乱やサンプルの自然放出など、常に時間遅延(補足図2および補足図3)に存在する背景特徴が含まれている場合があります。これらの望ましくない特徴は、対象種から過渡吸収信号を分離するために除去されなければならない¹¹。このような特徴の除去は、多数の負の時間差スペクトルの選択、平均化、および寄与の除去によって行われます。バックグラウンドスペクトルを選択するときは、対象プロセスの一部である可能性のある特徴が除去対象に含まれていないことを確認することが重要です。不純物や溶媒自体からの吸収など、溶媒から生じるバックグラウンドの特徴もTAデータで観察される場合があります。溶媒がシグナルを生成する場合、サンプルとまったく同じ実験条件下で分析された溶媒のみを含む「空白」データセットをサンプルデータセットから差し引く必要があります。この手順の詳細については、補足ファイル 3 を参照してください。

チャープ補正も慎重に検討すべき要素です。チャープは、プローブパルスがサンプルに伝わり、ステアリングミラーの欠陥や、レンズやフィルターなどの分散光学系を通過することによって広がるときに発生します。その結果、プローブパルスの低エネルギー光子(プローブスペクトルの赤側)が、高エネルギー光子(プローブスペクトルの青側)よりも先にサンプルに到達します。この結果、TAスペクトルの「時間ゼロ」が数フェムト秒またはピコ秒¹⁸にわたって不鮮明になり、青色の波長から始まり、赤色に近づくにつれて平坦になる生データセットの明確な曲線として現れます(補足図7)。チャープは、超高速TAがアクセスするような短い時間スケールで最も顕著です。この波長依存の時間ゼロは、プロトコルに記載されているように補正できますが、このプロセスの適用はトリッキーで主観的になる可能性があります。「ブランク」サンプルまたは溶媒Kerr応答の測定値を持つことで、チャープの調整と補正に使用される多項式近似を生成するために必要なチャープ補正ポイントを手作業で選択することの主観的な性質を最小限に抑えることができます。チャープ補正の目的は、時間ゼロの明確な「曲線」を取り除くことです。最適なチャープ補正データを得るには、チャープを当てはめるために複数回の試行が必要になる場合があります。チャープ補正が短いTAライフタイムの値に与える影響を理解するために、異なるチャープ補正を適用してデータを複数回当てはめることができます。

「タイムゼロ」に出現するアーティファクト
TAデータでは、レイリー散乱、誘導ラマン散乱、クロスフェーズ変調など、いくつかのアーティファクトが「時間ゼロ」近くで観察されます。ポンプビームのレイリー散乱は、エネルギーを変化させることなく生じる弾性散乱です。この特徴は、ポンプパルスと同じ波長で現れます。誘導ラマン散乱は、ポンプ散乱信号¹⁹に伴っていてもよい。ラマン散乱は、ポンプ光子の非弾性散乱に起因し、入射ポンプエネルギーよりも高いエネルギー(反ストークス)と低いエネルギー(ストークス)の両方にピークを生成します。TAデータでは、試料にポンプビームとプローブビームを同時に照射することで誘導ラマン散乱が観察されます。プローブビームがポンプビームと同時にサンプルと相互作用すると、ラマンプロセスが刺激されます。したがって、誘導ラマン散乱は時間ゼロ付近で発生し、最初の数百フェムト秒以内にスペクトルに追加のピークが生じます(図6、強調表示された領域の濃い青色のスペクトルと 補足図17で観察)。交差位相変調は、パルスの強い電界との相互作用による溶媒屈折率の変調に由来します。

誘導ラマン散乱は、ラマンピークが溶媒の振動モードに対応する特定の周波数に現れるため、交差相変調と区別できます。これはラマンプロセスであるため、励起の両側にストークス線と反ストークス線の両方が観察されます。塩化メチレンのような塩素系溶媒は、塩素の分極性が大きいため、非常に顕著なラマンバンドを示します。交差相変調のスペクトルシグネチャーは溶媒に固有ですが、ラマン散乱の特徴ほど簡単には予測できません。

測定するサンプルの動力学によっては、レイリー散乱、ラマン散乱、および交差位相変調がTAデータの初期の特徴と重複する場合があり、データから削除するのが難しい場合があります。原理的には、これらの特徴はきちんとした溶媒測定で確認し、データから差し引くことができ、データ分析プログラムはこれらの特徴を説明するための適切な機能を持っているかもしれませんが、実際にはこれは難しい場合があります。サンプルデータを損なうことなくこれらのアーティファクトを差し引くことが難しすぎる場合は、時間ゼロ付近で侵害されたスペクトルを切り取ってアーティファクトを排除する方が良い場合があります。これを行うと、最初の約 300 fs のデータが削除されるという残念な副作用がありますが、後でフィッティングの信頼性が高まります。同じサンプルと異なるサンプルの複数のデータセットを分析する過程で、初心者は、背景サーフェスを差し引くことと、最初の100〜200fsデータを切り取ることのバランスをとることを直感的に理解できるようになります。

一般的なトリミング は、S/N比が低いスペクトルの部分に対して必要になる場合があります。特定の領域でのプローブビームの不安定性、プローブ光の強度の低さ、サンプル濃度が高すぎる(その結果、入射プローブの多くがブロックされる)、ポンプ強度の低さ、サンプルの吸収断面積は、データのフィッティングを困難にする低S/Nの典型的な原因です。このような場合、光学窓の両側でデータセットをトリミングして、必要なレベルのS/N比を達成すると、フィッティングプロセスに役立ちます。

データセットは、データセットの不適切な部分を削除するために十分にトリミングされ、チャープが修正され、バックグラウンドスペクトルが平均化および減算されると、分析の準備が整います。この手順により、関心のある光物理学と光化学に最も関連する部分のみを含むデータが得られます。確かに、このプロセスにはある程度の主観性があることは明らかです。データ準備の目標は、フィッティングを混乱させないようにアーティファクトを除去することと、データセットの整合性を損ない、解釈を妨げるほどアーティファクトを除去しないことのバランスを取ることです。このバランスを見つけるには、何がアーティファクトで何がデータなのかについての直感を構築するための時間と経験が必要です。同じデータセットを複数の異なる日に当てはめたり、2人の研究者が同じデータを当てはめたりすることで、人為的ミスやデータの準備や分析の主観性を最小限に抑えることができます。

フィッティングと解釈に関する一般的な考慮事項
生のTAスペクトルが処理された後、それらを解釈およびモデル化して、対象システムに存在する種とダイナミクスに関する情報を抽出する必要があります。このプロセスは、初期スペクトル解釈、定量的モデリング/フィッティング、およびスペクトル解釈のモデル/フィッティングへの割り当てを含む3段階の手順として説明できます。

初期スペクトル解釈: スペクトル解釈ステップの目標は、TAスペクトルに存在する特徴を、システムの光物理学的または光化学的進化でアクセスされる電子状態に割り当てることです。まず、さまざまな状態を特定する必要があります。この研究では、 状態 とは、システムの光物理学的または光化学的進化の一部である固有の電子状態を指します。例えば、1つの特定のポテンシャルエネルギー曲線(PEC)で表される状態は、その吸収スペクトルを表す一連の特徴的なピークを持っています。1 つの状態内で発生する変更は、 プロセスと呼ばれます。光物理過程は、ピークシフトまたはスペクトル幅の変化としてTAスペクトルに現れることがあります。プロセスの重要な側面は、州の人口が同じままである(つまり、プロセスが特定のPEC内で発生する)ことです。変化するのは、状態内のエネルギーの分布です。州の人口の変化は、 移行と呼ばれます。遷移中、システムは別のPEC(電子状態)に進化します。遷移には、内部変換(IC)、システム間交差(ISC)、電荷移動、エネルギー移動、新製品の形成、または基底状態への復帰が含まれます。状態、プロセス、および遷移を割り当てるためのガイドラインについては、次の段落で説明します。

状態の割り当て
このプロセスの最初のステップでは、スペクトルの特徴を特定の化学種または状態に割り当てます。TAの_S1 状態は、時間分解発光分光法を用いてとった蛍光寿命と一致する寿命を示すべきである。三重項状態は、その寿命が酸素によって消光される場合に検証できます。光物理進化においてラジカルアニオンやカチオンが疑われる場合は、分光電気化学や化学的酸化・還元を行ってラジカル種を生成し、その種の吸収スペクトルを得てTAバンド形状と比較することができます。電子スピン共鳴(ESR)分光法は、フリーラジカルの存在を確認するために実行できます。ACS Division of Inorganic Chemistryが主催する優れたチュートリアルトークでは、TAの概要と、特徴量²⁰を割り当てる際の考慮事項が説明されています。バンドを種に割り当てた後、TAスペクトルを解釈する次のステップは、システム内で発生する動的プロセスを定性的に記述することです。このステップは、研究者にシステムの記述にどのモデルが適切かについてのアイデアを出し、近似パラメータを比較するためのベースラインを与えるため、非常に重要です。

ステート内の変更
振動冷却、幾何学的再配列、または溶媒和は、TAで観察できる非常に急速なプロセス(サブpsから10ps)です。振動冷却は、数ピコ秒の時間スケール^21,22,23におけるTAスペクトルの急速な青色シフトとして観察される。幾何学的再配置は、10 の ps タイムスケールで発生する可能性があります。溶媒和ダイナミクスは、従来の双極子液体では数ピコ秒にわたる赤方偏移とスペクトルの狭窄として観察されますが、グリセロール、ポリエチレングリコール(PEG)、イオン液体、深部共晶溶媒などの高粘度溶媒は、数ナノ秒にわたって発生する溶媒和ダイナミクスを示す可能性があります24,25,26。

州の人口の変化
反応はバンドの強度の変化によって特徴付けられ、強度の低下はその化学種の濃度の減少と関連し、 その逆 も増加します。反応物と生成物の両方の種がスペクトルに見える場合もあれば、生成物の状態が短命であったり、赤方偏移が大きすぎて観察できない場合もあります。多くの場合、状態間の遷移は、スペクトルに等ベスト点が存在することによって観察できます。

定量的モデリング/フィッティング: システムのダイナミクスに関する定量的情報を抽出するために、モデルをデータに適合させる必要があります。冒頭で前述したように、使用するモデルは多種多様です。このプロトコルは、最も一般的な2つの方法、すなわち単一波長フィッティングとグローバル分析に焦点を当てています。単一波長法では、スペクトルの個々の波長トレースを何らかの機能形式(通常は指数関数の合計)に当てはめます。

(2)

ここで、ΔA(t)は選択した波長におけるTA信号、nは指数成分の数、a_iは時定数_τiの指数成分iの振幅です。近似によって実験データが再現されるまで、いくつかの成分を追加できます。近似プロセスの目的は、データを適切に再現するのに十分な有効期間を使用してデータをモデル化することですが、含める成分が多すぎてデータを過剰適合させないようにします。したがって、などの重み付けされた適合度パラメータは、データが実験の不確実性⁵内でいつ適合するかを判断するのに役立ちます。

減衰が十分にフィットした後、モデルのパラメータを使用してシステムのダイナミクスを特徴付けることができます。その後、結果の時定数を抽出して解釈できます。残念なことに、TAスペクトルには多数の重複する特徴があるため、スペクトル内の単一の波長には、スペクトルシグネチャーが重複する異なる種に対応するダイナミクスが含まれている可能性があり、単一の波長の適合から抽出された時定数は、複数の一致プロセスの複合体を表す可能性があります。さらに、バンド形状と位置の変化は、単一波長フィッティングから抽出される振幅と時定数にも影響します。これらの問題は、システム内の各吸収種のTAバンドの関数形式を決定または仮定する「バンド形状分析」と呼ばれるフィッティング法によって回避できる場合があります。次に、これらの形状を時間依存の振幅で重み付けし、合計して観測されたスペクトルを再現します。この手順は、時間分解蛍光スペクトルの分析で一般的に使用されますが、TAバンドのより複雑な形状と重なり合う成分により、この方法は、他の場所で詳述されているように、いくつかの単純なケースでのみ有効になります¹⁰。

単一波長フィッティングのもう一つの欠点は、現代のTA実験によってもたらされる広いスペクトル範囲を本質的に利用できないことです。原理的には、スペクトルの個々の波長を系統的に当てはめることができますが、そのような分析は面倒で時間がかかり、計算コストがかかります。この課題に対処するために、「グローバル解析」と呼ばれる方法を使用して、TAスペクトルのセット全体を共有された^{動的パラメータの}セットに同時に適合させることができます4。グローバル分析と、ターゲット分析と呼ばれる密接に関連する手法は、成功し、広く使用されている手法ですが、独自の欠点と制限もあります。他のモデルと同様に、モデルの作成に使用される仮定と、それがもたらす制限を理解することが不可欠です。

大域解析では、TAスペクトルはm×nの行列で表され、mは各スペクトルで測定された波長の数、nは収集された時点の数を表します。この行列は、他の 2 つの行列の積に分解可能であると仮定されます。

(3)

ここで、C(t) は n x k 行列、S(λ) は m x k 行列です。値 k は、スペクトルの再現に使用される個別のスペクトル成分の数を表します。これらの各成分は、独自のスペクトル特性とダイナミクスを持つ吸収種を表しています。S(λ)行列はk成分のTAスペクトルを表し、C(t)はそれらの時間依存濃度を表します。大域解析の最も単純で最も一般的な実装では、各成分は単一指数動力学(式2のi = 1、各成分には独自の時定数が割り当てられている)を持つと仮定します。要約すると、完全なTAスペクトルは、それぞれ独自の特徴的な吸収スペクトルと単一の指数関数的減衰を持つkスペクトル成分の合計で表すことができます。

TAスペクトルが適合すると、ユーザーは必要な成分の数(つまり、kの値)を推測し、それらの種の単一指数関数的崩壊に関連する時定数を推測します。次に、フィッタは C_{の guess}(t) を生成し、S_fit(t) について式 3 を解きます。次に、式 3 のように S_fit(λ) と C_guess(t) を乗算して、近似スペクトル ΔA(λ,t)_fit を作成します。最後に、残差 ΔA(λ,t)_exp − A(λ,t)_fit が最小化され、最適な S_近似 (λ) と時定数が返されます。大域分析は比較的単純で、少数の時定数と固定スペクトル成分を使用してスペクトルのセット全体を表すため、TA分光法で遭遇する複雑なバンド形状とダイナミクスを解きほぐすための魅力的な(そして成功した)方法となっています。ただし、大域分析が手元のシステムに適したモデルであることを確認するには注意が必要です。

式 3 に示す大域解析における重要な仮定は、ダイナミクスの波長部分と時間部分の完全な分離可能性、つまり「双線形性」と呼ばれる特性です。この仮定では、 成分のバンド形状が時間に依存しない(つまり、時間とともに変化またはシフトしない固定スペクトル形状を持つ)必要があります。実験中に変化するのは、C(t)で表される各成分の相対的な母集団だけです。~1 ns 程度の長い時間スケールでは、この仮定が一般的に成り立ち、大域解析をあまり気にせずに使用できます。一方、振動冷却や溶媒和ダイナミクスなどの励起状態過程は、フェムト秒TAでアクセス可能な超高速時間スケールで顕著であり、種のスペクトルシグネチャーに時間依存的な変化をもたらし、双線形性の崩壊をもたらします。これは、グローバル分析でデータセットを再現できないという意味ではなく、実際、十分な数のコンポーネントが使用されていれば、常に満足のいく適合を生成できます。問題は、成分スペクトルを解釈し、特定の励起状態プロセスに時定数を割り当てることであり、成分はもはや異なる吸収種に対応していない可能性があるためです。したがって、双一次性を想定できない状況に大域解析を適用する場合は、常に注意が必要です。

モデル/フィッティングへのスペクトル解釈の割り当て: 近似が得られたら、スペクトル解釈を近似で得られた寿命にマッピングする必要があります。近似からの寿命は、スペクトルの初期解釈で特定されたプロセスと反応の両方に割り当てられます。ただし、スペクトルからの初期評価と、モデルによって得られた適合寿命の数は、すぐには相互にマッピングされない場合があります。このような(一般的な)状況では、フィッターは最初の解釈に戻って評価する必要があります。おそらく、振動冷却やその他のプロセスがあり、初期評価では見落とされていましたが、モデリングとフィッティングのプロセスで特定されました。あるいは、2つの異なる近似パラメータのセットでデータをうまく再現し、最初の解釈によってどの近似パラメータのセットが選択されるかがわかるかもしれません。この最後のステップでは、フィッターは解釈とフィッティングを行ったり来たりして、システムの種とダイナミクスのもっともらしい光物理学的割り当てにつながる説明を見つけなければなりません。ターゲット分析など、逐次フィットモデルを含む他のフィッティングプログラムも、グローバル解析とこの記事⁴で紹介するフィッティングソフトウェアによって得られるフィットを補完するために検討できます。

要約すると、このプロトコルでは、過渡吸収データの準備とフィッティングについて説明します。その目的は、プロセスに関連する課題を強調し、これらの課題を実用的な方法で回避または軽減する方法についてコメントすることです。TAデータのフィッティングは、技術分野で遭遇するほとんどのデータのフィッティングと同様に、トリッキーであり、時には主観的なものです。したがって、データのプロセスと制限、データの準備、およびデータをモデル化してデータに意味を割り当てるために使用される数学的ツールを認識することが重要です。科学者は、批判的な目でデータとモデリングにアプローチする必要があります。

その適合の主観性を緩和しようとする試みはできます。たとえば、異なる開始点から異なる日にデータを準備して適合させることで、同じ適合が得られるようにすることができます。異なるサンプル前処理で異なる日に撮影されたデータを比較できます。複数の研究者が同じデータを当てはめ、その結果を比較することができます。時間が経つにつれて、研究者は(実験セットアップと実験パラメータの詳細に基づいて)得られたデータについて直感を構築でき、適合に自信を持つことができます。

TAデータフィッティングと、この記事で説明したモデルの詳細について学ぶべきことはたくさんあります。このトピックを深く掘り下げたいくつかの優れたレビュー記事が熱心に推奨されています^4,10,27。このプロトコルは、分析とフィッティングのプロセスへの初心者の入り口となることを意図しており、プロセスをより深く理解することへの関心を刺激します。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
EtOH 200% Proof	Decon Laboratories Inc	CAS 64-17-5	Solvent used to prepare Sample
Helios transient absorption spectrometer	Ultrafast systems	https://ultrafast.systems/products/spectrometers-accessories/helios/	Transient absorption spectrometer
POPOP  1,4-Bis[2-(5-phenyloxazolyl)]benzene	Tokyo Chemical Industry	CAS 1806-34-4	Sample used for Examples
Surface Xplorer	Ultrafast systems	https://ultrafast.systems/products/spectrometers-accessories/surface-xplorer/	Fitting program