Summary
在这里,我们提供了一个实用的程序,用于解剖和执行小鼠锁骨上棕色脂肪组织的组织学和基因表达分析。
Abstract
棕色脂肪组织(BAT)介导的产热在代谢的调节中起着重要作用,其形态和功能在小鼠和人类中受到环境刺激的影响很大。目前,小鼠肩胛间 BAT (iBAT) 位于小鼠上背侧的两个肩胛骨之间,是研究实验室用于研究 BAT 功能的主要 BAT 库。最近,在小鼠中发现了一些以前未知的BAT库,包括一种类似于人类锁骨上棕色脂肪组织的细胞库。与 iBAT 不同,小鼠锁骨上棕色脂肪组织 (scBAT) 位于颈部的中间层,因此不容易进入。
为了促进对新鉴定的小鼠scBAT的研究,本文介绍的方案详细说明了从出生后和成年小鼠中解剖完整scBAT的步骤。由于scBAT的尺寸相对于其他脂肪库较小,因此专门针对处理scBAT的程序进行了修改和优化。这些改进包括在组织采集过程中使用解剖显微镜来提高冷冻scBAT样品的精密度和均质化程度,从而提高后续qPCR分析的效率。通过这些优化,可以在小鼠中确定scBAT的鉴定、形态学外观和分子特征。
Introduction
肥胖症在美国和全球的患病率不断上升,引发了人们对了解其病因和确定潜在治疗方法的极大兴趣1,2。脂肪组织在新陈代谢中起着至关重要的作用,脂肪组织的失调会导致肥胖的发展。一般来说,脂肪组织有两种类型,白色和棕色脂肪组织。白色脂肪组织 (WAT) 可以储存化学能并分泌内分泌因子,而棕色脂肪组织 (BAT) 可以利用化学能产生热量并在寒冷中保持体温 3,4。由于这种独特的能力,BAT 的激活还可以增加能量消耗并提高胰岛素敏感性5。
BAT 通过非颤抖产热发挥其功能,该过程由解偶联蛋白 1 (UCP1) 介导6。哺乳动物,包括小鼠和人类,拥有不同数量的BAT。BAT的经典观点是,这些脂肪组织在小鼠和婴儿中比在成年人类中更丰富。iBAT位于肩胛骨之间的上背侧,是小鼠中研究最多的BAT库。通过应用放射性同位素成像和活检测试,最近的研究在成年人类中发现了几个BAT库。其中一些,包括在颈部深部和锁骨上区域发现的仓库,以前没有在小鼠或其他模式动物中鉴定出来7,8,9,10,11。在这些 BAT 仓库中,scBAT 是成年人中最常见的仓库。为了更好地了解这些新发现的BAT库在人类中的起源和分子贡献,必须确定小鼠体内的等效库,这些库允许遗传和分子操作来追踪和测试这些库的功能作用。因此,我们和其他人在小鼠的不同解剖位置发现了一些以前未知的 BAT 库,包括 scBAT12,13、胸血管周围 BAT14,15、肾周 BAT16 和主动脉周围 BAT17。小鼠scBAT在解剖学上与人类scBAT相似,形态学上与经典iBAT相似,表达高水平的UCP112。
与易于解剖的小鼠 iBAT 不同,scBAT 位于小鼠颈部的中间层、唾液腺下方和颈外静脉。分离该库进行组织学和分子分析可能具有挑战性。在这里,我们详细描述了从出生后和成年小鼠中解剖scBAT并处理该库进行组织学和基因表达分析的过程。
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Protocol
动物程序已获得贝勒医学院机构动物护理和使用委员会的批准。所有程序均在3周龄和3个月大的C57BL / 6J雄性小鼠上进行。在解剖之前,所有小鼠都使用批准的啮齿动物二氧化碳安乐死程序进行安乐死。有关本协议中使用的所有材料、试剂和仪器的详细信息,请参阅材料表。
1. scBAT的解剖
- 将小鼠尸体放在工作台上,用70%乙醇清洁手术剪刀和超细尖镊子。
- 用 70% 乙醇喷洒小鼠的腹颈,以润湿皮毛并最大限度地减少毛皮污染。
- 沿着锁骨做一个约 1.5 厘米的双侧切口。
- 从前一个切口的末端,向耳朵纵向切割,长约1厘米。这将在颈部周围形成一个方形的U形切口(图1A,B)。
注意:scBAT位于颈部的中间层。在此步骤中,由皮肤、皮下脂肪组织和唾液腺组成的表层暴露在外。中间层与scBAT一起包含颈静脉和颈部肌肉。颈部深层,包含颈部深部 BAT 以及动脉和颈静脉,通过去除骨骼肌暴露出来。 - 将小鼠置于解剖显微镜下,使暴露的颈部聚焦(图1C)。
注意:这个增加的步骤大大提高了组织收集的精度,这是必要的,因为scBAT的尺寸很小。 - 用镊子将切开的皮肤部分完全暴露唾液腺。
- 使用手术剪刀和镊子,断开连接唾液腺与锁骨周围组织以及彼此之间的组织。
- 通过抬起唾液腺暴露scBAT库。沿颈外静脉寻找 BAT,并可能连接到唾液腺的下侧。通过其橙色来识别它,在周围组织中脱颖而出。
- 用镊子握住目标脂肪组织,轻轻地将其从唾液腺中剥离。
- 一旦与唾液腺分离,继续断开scBAT与颈外静脉和颈部肌肉组织的连接,直到颈部两侧的仓库可以全部切除。
- 在解剖显微镜下检查每个解剖的scBAT样品(图1D,E),使用镊子去除任何残留的结缔组织。
- 将每个样品放入含有 10 mL 磷酸盐缓冲盐水溶液 (PBS) 的玻璃闪烁瓶中,然后从显微镜下取出小鼠。
2. scBAT的加工和苏木精和伊红(H&E)染色 ( 如图2A所示)
- 用10mL冷的4%多聚甲醛(PFA)代替PBS(步骤1.12),并将小瓶放在螺纹器上,在4°C下摇动过夜以固定scBAT。
注意:当需要进一步处理免疫组化分析时,灌注固定可用于出生后,特别是成年小鼠。 - 第二天,用无菌移液管从小瓶中取出PFA溶液,并用10-15mLPBS代替。将小瓶放在螺纹器上,在室温下摇晃30分钟。用0.85%盐水溶液代替PBS,并在室温下继续摇动30分钟。
注意:盐水溶液在DEPC处理的水(不含RNase)中为0.85%盐水(NaCl) w / v。PBS可以代替本步骤和后续步骤中的盐水溶液。 - 用移液管除去 0.85% 生理盐水,并向小瓶中加入 10 mL 70% 乙醇/0.85% 生理盐水溶液。将小瓶存放在4°C冰箱中过夜或直到准备好嵌入石蜡。
注意:如果没有 0.85% 盐水,则可以使用 PBS。scBAT应尽快处理,以便于切片和更好地保存组织形态。 - 在石蜡包埋之前,通过一系列乙醇交换使scBAT脱水,以去除组织中的水分。
- 首先,用移液管从小瓶中除去70%乙醇/ 0.85%盐水,并加入10-15mL95%脱水酒精,在室温下在导向器上摇晃小瓶1小时。重复此步骤一次。
注意:乙醇可用于代替脱水剂酒精溶液。 - 接下来,用10-15mL的100%脱水酒精代替95%脱水酒精,并继续在螺纹上摇摆1小时。重新装满新的 100% 脱水酒精并继续摇晃数小时或过夜,具体取决于小瓶中 scBAT 的数量。
- 首先,用移液管从小瓶中除去70%乙醇/ 0.85%盐水,并加入10-15mL95%脱水酒精,在室温下在导向器上摇晃小瓶1小时。重复此步骤一次。
- 要清除scBAT进行嵌入,请向小瓶中加入10mL甲苯,并继续在导杆上摇摆,直到scBAT透明,大约6-8小时。
注意:达到令人满意的清算所需的时间取决于 scBAT 的大小。建议在早上立即开始清理,以便在下午进行渗透和嵌入。 - 要将 scBAT 包埋在石蜡中,请除去甲苯并向小瓶中加入 10 mL 熔化的浸润石蜡。将小瓶置于65°C的烤箱中1小时。用新蜡重复此步骤。
注意: 在开始嵌入之前,开始在烤箱中熔化蜡颗粒过夜,以确保蜡是完全液态的。 - 用嵌入石蜡代替渗透石蜡,并将小瓶置于相同温度下1小时。重复此步骤一次。
注意:渗透阶段可以中断并在以后继续。从烤箱中取出小瓶并将其存放在室温下,直到准备好继续。 - 首先将组织放入组织包埋模具中,将熔化的包埋蜡添加到模具中,然后在立体显微镜下重新定向组织。然后,将包埋盒放在蜡的顶部,并继续将包埋蜡倒在其顶部,直到它装满并将包埋盖固定在蜡块上。将块转移到4°C冰箱过夜,让蜡变硬并收缩,然后再取出金属模具。
- 用切片机将scBAT切片至厚度为5-6μm18,每个显微镜载玻片三至四个切片,并置于~42°C的温石蜡切片浮浮浴中,以使组织切片平滑。
- 将部分转移到载玻片上,并将载玻片直立放在漂浮浴上,让水从载玻片上滴落。
- 将载玻片转移到不锈钢染色架上,然后将载玻片放在载玻片干燥台上晾干过夜。
注意:在进行进一步加工之前,石蜡载玻片可以在室温下长期储存。 - 进行 H&E 染色19.首先,将载玻片放入染色架中,然后将载玻片放入装有二甲苯的染色罐中40秒。重复此步骤一次。
注意: 如果石蜡在两个阶段后仍然可见,请等到它完全溶解后再继续。 - 要使组织再水化,请将载玻片架放入装有100%脱水酒精的染色罐中两个20秒阶段,然后在95%脱水酒精中进行15秒阶段,最后在ddH2O中冲洗15秒。
- 将载玻片置于装有苏木精溶液的染色皿中75秒以达到核染色,然后在用ddH2O染色皿中冲洗载玻片45秒。
注意: 时间可以根据所需的污渍颜色进行调整。 - 通过将载玻片浸入装有HCl-乙醇溶液的染色皿中15秒来区分染色,然后将载玻片转移到另一个ddH2O冲洗15秒。
注:HCl-乙醇溶液根据已发表的方法19制备。 - 对于细胞质染色,将载玻片置于曙红Y复染溶液中15秒。
- 通过在三个连续的 95% 脱水酒精溶液阶段中将载玻片浸泡 15 秒来脱水组织,然后进行两个连续的 100% 脱水酒精浴 - 第一个 15 秒,第二个 45 秒 - 完成脱水。
- 最后,将载玻片转移到二甲苯浴中45秒,以使组织重新适应有机溶剂。完成此步骤后,染色完成;从溶液中取出组织。
- 将安装介质涂在每张载玻片上,并将其盖在化学通风橱内。成像前晾干过夜。成像结果如 图2B所示。
3. scBAT的基因表达分析
- 组织收集(研磨)
- 解剖scBAT后,立即将组织放入微量离心管中,用无菌针头在管顶部戳一个孔,并在液氮中快速冷冻。
注意: 图3A说明了此处概述的协议的主要步骤。在将管子放入液氮之前,在管子顶部戳一个孔,可以防止管子因压力突然变化而爆裂。 - 用液氮填充塑料烧杯,然后留下杵和薄刮刀浸泡。
注意:在整个过程中,重要的是要保持所有工具和组织样品的温度尽可能低,接近液氮的温度,以防止组织解冻。解冻的脂肪组织具有很强的粘附性,使粉末化更具挑战性。仅在使用前立即从液氮浴中取出工具和样品。 - 一次取一个速冻组织样品,并将其从微量离心管倒入研钵中。
- 在研钵中加入少量液氮,然后用研杵研磨冷冻组织,直至完全粉碎。
注意:如果组织在任何时候开始变软或变粘,则说明它正在解冻;将更多的液氮倒入研钵中。 - 用薄刮刀小心地刮擦粉碎的组织并将其转移回微量离心管中。在刮擦的同时将液氮倒入研钵中,以收集剩余的组织碎片,然后用刮刀转移。重复转移步骤,直到从研钵中取出所有组织。
- 在倾倒下一个样品进行研磨之前,用轻型纸巾擦拭器和 70% 乙醇清洁砂浆。将粉末组织长期储存在-80°C冰箱中。
- 解剖scBAT后,立即将组织放入微量离心管中,用无菌针头在管顶部戳一个孔,并在液氮中快速冷冻。
- 总RNA分离
- 制备
- 用 70% 乙醇和表面去污剂清洁工作台、移液器、吸头支架和试管架,以去除 RNase。
- 运行离心机达到4°C。
- 将洗脱液加热至70°C。
- 通过将 5 μL 复溶的 DNase I 与每个样品的 75 μL DNase 稀释溶液混合来稀释 DNase I。将 DNase I 溶液放在冰上直至使用。
- 程序
- 对于每个样品,标记两个微量离心管、两个色谱柱保持管(两个无盖刻度微量离心管)和一个结合迷你柱。
- 向每个样品中加入 500 μL RNA 分离溶液,并使用沉淀杵电机超声处理 30 秒。
- 为每个样品取一个注射器,上下移液 10 次以进一步裂解组织。确保注射后看不到固体。
- 加入 250 μL 氯仿并偶尔涡旋,同时等待 5 分钟,使样品在室温下孵育。
- 在4°C下以21,000× g 离心20分钟。
- 将顶部水性部分转移到新的微量离心管中,并加入等量的70%乙醇(~500μL)。
注意:顶部水性部分应该是透明的,底部应该是红色RNA分离溶液,两层之间应该是一些不需要的固体。 - 将 500 μL 新裂解物转移到结合柱中。以18,000× g 离心60秒,然后弃去滤液。
- 对剩余的裂解物重复上一步,将所有RNA放入结合柱中。
- 向结合柱中加入700μL低严格洗涤液,离心30秒,弃去滤液。
- 向每个结合柱中加入 80 μL 稀释的 DNase I。在室温下孵育15分钟。
- 加入 700 μL 高严格洗涤液,离心 30 秒,弃去滤液。
- 加入 700 μL 低严格洗涤液,离心 60 秒,弃去滤液。
- 将结合柱移入第2个 新的无盖柱保持管中,并离心2分钟,以确保所有液体都从结合柱中除去。
- 将结合柱移至新的微量离心管中,并加入 30 μL 温热的洗脱溶液。在室温下孵育 1 分钟。
- 离心2分钟,在微量离心管底部收集洗脱的RNA。
- 使用分光光度计测量总RNA浓度。
注意:如果总RNA纯度较低,则由260/280值低于2.0或260/230值低于1.8表示,则在步骤3.2.2.12.之后,样品可以再次用低严格洗涤液洗涤,然后用80%乙醇洗涤,然后继续步骤3.2.2.13。 - 将RNA储存在-80°C冰箱中。
- 逆转录 (RT)
- 在PCR管条中,将0.5-1μg在DEPC处理的水中稀释的总RNA加入到不同的孔中,每个RNA样品总共8μL。
注意:用于逆转录的RNA量可以根据制造商的说明放大或缩小。 - 向PCR管中的每个样品中加入1μL寡核苷酸dT和1μLdNTP。确保每个样品的总体积为 10 μL。
- 将PCR管条置于热循环仪中,并将其设置为65°C5分钟,然后无限期地设置4°C。
- 在65°C下5分钟后,取出PCR管条并将管放在冰上至少2分钟。在冰上孵育后,向每个样品中加入五种试剂:4 μL 5x 第一链缓冲液、2 μL 25 mM MgCl2、2 μL 0.1 M DTT、1 μL RNase 抑制剂和 1 μL 逆转录酶。确保每个样品的总体积现在为 20 μL。
- 将PCR管条放回热循环仪中,并将程序设置为50°C50分钟,然后85°C5分钟,然后无限期地4°C。
- 程序达到4°C后,取出试纸条并加入1μL核糖核酸酶H(RNase H)。
注意:RNase H用于去除RT反应中任何剩余的RNA模板;通过此步骤,所需的RNA应该已经转化为cDNA。 - 将条带放回热循环仪中,在37°C下运行20分钟,然后无限期地在4°C下运行。
- 逆转录完成;使用分光光度计测量cDNA浓度。
- 将 cDNA 稀释至 250 ng/μL;将cDNA储存在-80°C或-20°C冰箱中。
- 在PCR管条中,将0.5-1μg在DEPC处理的水中稀释的总RNA加入到不同的孔中,每个RNA样品总共8μL。
- 定量PCR(qPCR)
- 制作一个电子表格,以组织每个引物和样品在 96 孔 qPCR 板上的位置。
注意:其中一个引物需要是参考基因,以使所有其他目标基因(如 36B4)的表达正常化。 - 为每个“引物+样品”组合制作引物预混液。向每个qPCR反应孔中加入3 μL分子生物学级水、5 μL qPCR酶预混液、0.5 μL正向引物和0.5 μL反向引物,每次反应加起来为9 μL。每个反应加入 1 μL cDNA,使每个反应孔总共 10 μL。
注意:标准是每个“引物+样品”组合有三个技术重复,因此每个预混液应为上述数量的 4 倍。 - 向每个引物预混液中加入 1 μL cDNA。如果每个预混液为 4 倍,则将每个样品 cDNA 的 4 μL 移液到它们自己标记的试管中。
- 最后,将每种反应混合物的 10 μL 移液到电子表格确定的位置的 96 孔 qPCR 板中。
- 用厚厚的粘性密封板密封板,然后在20°C下将96孔板在450× g 离心2分钟。
注意: 至关重要的是,板必须完全密封,以避免样品在热循环过程中蒸发。使用轻型纸巾擦拭器将密封件向下压在板上,尤其是边缘。 - 在实时荧光定量PCR仪器中运行板。根据制造商的说明对PCR反应进行编程:在50°C下2分钟,然后在95°C下再2分钟,最后在95°C下进行40个循环,在95°C下进行15秒,在60°C下进行30秒。 qPCR基因表达分析的结果如 图3B所示。
- 制作一个电子表格,以组织每个引物和样品在 96 孔 qPCR 板上的位置。
- 制备
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Representative Results
与位于两个肩胛骨之间的背部皮下层的 iBAT 不同,scBAT 位于颈部的中间层,在骨骼肌和唾液腺层之间延伸深处,因为它沿着颈外静脉生长(图 1A)。剖析 scBAT 并不像 iBAT 那么简单。在这里,我们提供了一个详细的程序,包括从出生后和成年小鼠中解剖完整scBAT的关键步骤(图1B,C)。使用提供的方案打开颈部后,可以在解剖显微镜下识别一层薄薄的scBAT并用镊子从连接的唾液腺和颈外静脉剥离(图1D,E)。为了评估仓库的形态,使用提供的处理程序结合先前发表的H&E染色程序19处理新鲜分离的scBAT(图2A)。如图2B所示,scBAT具有BAT库的典型组织结构,并且由健康出生后和成年小鼠中的许多小的多房脂肪细胞组成。为了评估scBAT中的基因表达水平,使用提供的程序从分离的scBAT库中提取RNA(图3A)。然后可以通过标准RT-qPCR方法评估目标基因的表达水平(图3A)。如图3B所示,参与介导scBAT功能的基因的表达水平不同,包括BAT发育的主要调节因子Pparg;Fabp4 和 Glut4,两种营养转运蛋白;Ucp1 和 Ppargc1a 是两个参与产热的基因,可以很容易地确定。为了进行比较,从分离的iBAT中提取RNA,并使用提供的程序评估上述基因的表达(图3A)。这两个库之间这些基因的表达水平相对相似。(图3B)。
图1:scBAT的解剖位置及其解剖过程。 (A) scBAT在颈部中间层的位置。(B)去除皮肤前后的颈部表层。比例尺 = 250 μm。黄色虚线勾勒出U形切口后应暴露的区域。(C) 放置在解剖显微镜下的小鼠尸体的图像,以增加解剖过程中的视觉清晰度。(D,E)从3周龄和3个月龄的小鼠中去除scBAT前后颈部中间层的代表性图像。比例尺 = 250 μm。黄色虚线勾勒出暴露的双边scBAT仓库;n = 2。缩写:scBAT = 锁骨上棕色脂肪组织;sfi = 表层;sg = 唾液腺;tr = 气管;JV = 颈外静脉;sm = 骨骼肌。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2:用于 H&E 染色的 scBAT 处理。 (A) 流程图说明了 H&E 染色的 scBAT 处理的主要步骤。解剖组织后,依次固定、脱水、包埋、切片和染色。(B)3周龄和3个月龄小鼠H&E染色scBAT的代表性图像;每个发育阶段的 n = 3;比例尺 = 250 μm,用于较低放大倍率的图像;比例尺 = 50 μm,用于更高放大倍率的图像。缩写:scBAT = 锁骨上棕色脂肪组织;PFA = 多聚甲醛;H&E = 苏木精和伊红。 请点击这里查看此图的较大版本.
图3:从scBAT制备用于基因表达分析的RNA。 (A) 说明scBAT基因表达的RNA分离和RT-qPCR分析阶段的流程图。由于其体积小、质地柔软,快速冷冻scBAT库并在液氮中研磨对于成功分离RNA至关重要。 (B) 标记基因的相对表达,包括 Pparg、 Fabp4、 Glut4、 Ucp1 和 Ppargc1a,在从 3 个月龄雄性小鼠中分离的 scBAT 和 iBAT,n = 5。数据以平均±SEM表示。 36B4 被用作归一化的管家基因。缩写:scBAT = 锁骨上棕色脂肪组织;RT-qPCR = 逆转录定量PCR;LN2 = 液氮。 请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
在该方案中,我们详细介绍了用于H&E和基因表达分析的解剖和处理scBAT的程序。由于scBAT位于颈部的中间层,并位于大静脉中,因此该库的分离需要精确的技术。具体来说,为了获得仓库的清晰视图,我们建议在颈部打开后将小鼠置于解剖显微镜下。使用一对超细尖镊子从唾液腺和周围静脉剥离 scBAT,应注意避免刺穿静脉。出血过多会使 scBAT 更难定位。为了处理用于 H&E 染色的 scBAT,我们调整了已公布的方案19 的使用,并进行了轻微的修改,包括使用 4% PFA、脱水醇和有机溶剂甲苯进行组织处理,如方案部分所示。整个过程需要 ~6 天才能完成,H&E 染色的载玻片可以在染色完成后的第二天成像。
以RNA为起始材料的RT-qPCR是脂肪组织生物学领域最常用的基因表达分析方法。由于与 iBAT 相比,scBAT 是一个相对较小的 BAT 库,因此很难获得足够的 RNA 进行基因表达。为了提高RNA产量,我们建议应用方案部分概述的顺序裂解物制备步骤,首先在冷冻时使用研杵和研钵将组织粉化。使用这种裂解物制备方法,我们成功地从一只成年小鼠身上获得了用于scBAT基因表达分析的高产量和高质量RNA样品。该裂解物制备方法也可用于使用蛋白质裂解缓冲液从scBAT中获得高质量的蛋白质裂解物,用于蛋白质印迹。
使用小鼠 iBAT,研究人员已经获得了有关 BAT 在产热和代谢中的功能的大量知识。最近在小鼠和人类中发现了一些以前未被识别的BAT库,包括scBAT,揭示了在我们完全了解BAT在小鼠和成年人类中的生理贡献之前,需要更多的研究。特别是,有必要研究阐明这些新发现的 BAT 库的起源、功能和参与产热和区域或全身代谢。
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Disclosures
作者没有需要披露的利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了美国国立卫生研究院(NIH)的NIDDK的支持,奖励编号为R01DK116899,USDA / ARS的奖励编号为3092-51000-064-000D,以及贝勒医学院心血管研究所的试点奖。流程图是使用 BioRender 制作的。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
95% Dehydrant Alcohol (Flex 95) | Epredia | 8201 | |
100% Dehydrant Alcohol (Flex 100) | Epredia | 8101 | |
96-well PCR plate | Bio-Rad | MLL9601 | |
Aurum Binding Mini Column | Bio-Rad | 7326826 | |
Aurum High Stringency Wash | Bio-Rad | 7326803 | |
Aurum Low Stringency Wash | Bio-Rad | 7326804 | |
Base Molds (for embedding) | Tissue-Tek | 4122 | |
BD PrecisionGlide Needle 21g x 1 1/2" | Becton Dickinson | 305167 | |
C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1840148 | |
Capless Microcentrifuge Tubes 2 mL | Fisherbrand | 02-681-453 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5430R | |
CFX Opus 96 Real-Time PCR Instrument | Bio-Rad | 12011319 | |
Chloroform | Thermo Scientific Chemicals | 383760010 | |
Cytoseal 60 Low-viscosity mounting medium | Epredia | 83104 | |
DEPC-Treated Water | Ambion | AM 9906 | |
Dissecting Microscope | Nikon | SMZ1500 | |
DNase Dilution Solution | Bio-Rad | 7326805 | |
DNase I | Bio-Rad | 7326828 | |
dNTPs | Invitrogen | 18427013 | |
Elution solution | Bio-Rad | 7326801 | |
EM 400 embedding medium paraffin | Leica Biosystems | 3801320 | |
Eosin Y (0.5% w/v) | RICCA | 2858-16 | |
Formula R Infiltration medium paraffin | Leica Biosystems | 3801470 | |
Genemark Nutator Gyromixer 349 | Bio Express | S-3200-2 | |
Gill #3 Hematoxylin | Sigma-Aldrich | GHS332-1L | |
HCl (for HCL-Ethanol) | Fisher Chemical | A142212 | |
IP VI Embedding Cassettes | Leica Biosystems | 39LC-550-5-L | |
Koptec's Pure Ethanol - 200 Proof (for 70% Ethanol) | Decon Labs | V1001 | |
MgCl2 (25 mM) | Thermo Fisher Scientific | R0971 | |
Microcentrifuge Tubes 1.7 mL | Avantor | 87003-294 | |
Microseal 'B' Seals (adhseive seals) | Bio-Rad | MSB1001 | |
Microtome | Leica Biosystems | RM2245 | |
Molecular Biology Grade Water | Corning | 46-000-CM | |
Mortar Coors Tek | Thomas Scientific | 60310 | |
NaCl (for 0.85% saline) | Fisher Bioreagents | BP358-212 | |
NanoDrop Spectrophotometer | NanoDrop Technologies | ND-1000 UV/Vis | |
Oligo dT | Invitrogen | 18418020 | |
Paraffin Section Flotation Bath | Boekel Scientific | 14792V | |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148-500G | |
PCR Tube Strip | Avantor | 76318-802 | |
Pestle by Coors Tek | Thomas Scientific | 60311 | |
Pestle Pellet Motor | Kimble | 749540-0000 | |
Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
Precision Model 19 Vacuum Oven | Thermo Fisher Scientific | CAT# 51221162 | |
Primer: 36B4 (forward) 10 μM 5' TGA AGT GCT CGA CAT CAC AGA GCA 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
Primer: 36B4 (reverse) 10 μM 5' GCT TGT ACC CAT TGA TGA TGG AGT GT 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
Primer: Fabp4 (forward) 10 μM 5’ ACA CCG AGA TTT CCT TCA AAC TG 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
Primer: Fabp4 (reverse) 10 μM 5’ CCA TCT AGG GTT ATG ATG CTC TTC A 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
Primer: Glut 4 (forward primer) 10 μM 5’ CTG ATT CTG CTG CCC TTC TGT CCT 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
Primer: Glut 4 (reverse) 10 μM 5’ GAC ATT GGA CGC TCT CTC TCC AAC TT 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
Primer: PPARg (forward) 10 μM 5’ AGG GCG ATC TTG ACA GGA AAG ACA 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
Primer: PPARg (reserve) 10 μM 5’ AAA TTC GGA TGG CCA CCT CTT TGC 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
Primer: Ppargc1a (reverse) 10 μM 5' ATG TTG CGA CTG CGG TTG TGT ATG 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
Primer: Ppargc1a(forward) 10 μM 5' ACG TCC CTG CTC AGA GCT TCT CA 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
Primer: Ucp1 (forward) 10 μM 5’ AGC CAC CAC AGA AAG CTT GTC AAC 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
Primer: Ucp1 (reverse) 10 μM 5’ ACA GCT TGG TAC GCT TGG GTA CTG 3’ |
Chen lab Oligo database | ||
RNA isolation solution (PureZol) | Bio-Rad | 7326880 | |
RNase Away (surface decontaminant) | Thermo Scientific | 1437535 | |
RNase H | NEB | M0297S | |
Rnase inhibitor (RNase Out) | Invitrogen | 10777019 | |
Scintillation Vial (glass) | Electron Microscopy Sciences | 72632 | |
Slide drying bench | Electrothermal (Cole-Parmer) | MH6616 | |
Stainless staining rack | Electron Microscopy Sciences | 70312-54 | |
Stereo microscope (for embedding) | Olympus | SZ51 | |
Sugical scissors | McKesson | 43-1-104 | |
Superfine point Straight Dissecting Forceps | Avantor | 82027-402 | |
Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
Superscript III Reverse Transcriptase (Includes 5x First-Strand Buffer and 0.1M DTT) | Invitrogen | 18080044 | |
SUR-VET syringe with needle 25 G x 5/8", 1 mL | Terumo | 100281 | |
SYBR Green (qPCR enzyme master mixture) | Applied Biosystems | A25778 | |
Tissue-Tek Manual Slide Staining Set (jars) | Electron Microscopy Sciences | SKU: 62540-01 | |
Toluene | Fisher Chemical | T324-1 | |
Transfer pipette | Avantor | 414004-005 | |
Xylene | Fisher Chemical | X3P-1GAL |
References
- Boutari, C., Mantzoros, C. S. A 2022 update on the epidemiology of obesity and a call to action: as its twin COVID-19 pandemic appears to be receding, the obesity and dysmetabolism pandemic continues to rage on. Metabolism. 133, 155217 (2022).
- Hales, C. M., Carroll, M. D., Fryar, C. D., Ogden, C. L. Prevalence of obesity and severe obesity among adults: United States, 2017-2018. NCHS Data Brief. (360), 1-8 (2020).
- Berry, D. C., Stenesen, D., Zeve, D., Graff, J. M. The developmental origins of adipose tissue. Development. 140 (19), 3939-3949 (2013).
- Wang, W., Seale, P. Control of brown and beige fat development. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (11), 691-702 (2016).
- Maliszewska, K., Kretowski, A. Brown adipose tissue and its role in insulin and glucose homeostasis. Int J Mol Sci. 22 (4), 1530 (2021).
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiol Rev. 84 (1), 277-359 (2004).
- Cypess, A. M., et al. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. N Engl J Med. 360 (15), 1509-1517 (2009).
- van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. Cold-activated brown adipose tissue in healthy men. N Engl J Med. 360 (15), 1500-1508 (2009).
- Virtanen, K. A., et al. Functional brown adipose tissue in healthy adults. N Engl J Med. 360 (15), 1518-1525 (2009).
- Cypess, A. M., et al. Anatomical localization, gene expression profiling and functional characterization of adult human neck brown fat. Nat Med. 19 (5), 635-639 (2013).
- Leitner, B. P., et al. Mapping of human brown adipose tissue in lean and obese young men. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (32), 8649-8654 (2017).
- Mo, Q., et al. Identification and characterization of a supraclavicular brown adipose tissue in mice. JCI Insight. 2 (11), e93166 (2017).
- Shi, Y., et al. Gene Expression Analysis of Environmental Temperature and High-Fat Diet-Induced Changes in Mouse Supraclavicular Brown Adipose Tissue. Cells. 10 (6), 1370 (2021).
- Chang, L., et al. Loss of perivascular adipose tissue on peroxisome proliferator-activated receptor-gamma deletion in smooth muscle cells impairs intravascular thermoregulation and enhances atherosclerosis. Circulation. 126 (9), 1067-1078 (2012).
- Ye, M., et al. Developmental and functional characteristics of the thoracic aorta perivascular adipocyte. Cell Mol Life Sci. 76 (4), 777-789 (2019).
- de Jong, J. M., Larsson, O., Cannon, B., Nedergaard, J. A stringent validation of mouse adipose tissue identity markers. Am J Physiol Endocrinol Metab. 308 (12), E1085-E1105 (2015).
- Fu, M., et al. Neural crest cells differentiate into brown adipocytes and contribute to periaortic arch adipose tissue formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 39 (8), 1629-1644 (2019).
- Tucker, D. K., Foley, J. F., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Sectioning mammary gland whole mounts for lesion identification. J Vis Exp. (125), e55796 (2017).
- Berry, R., et al.
Imaging of adipose tissue. Methods Enzymol. 537, 47-73 (2014).