Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

ثنائي الفوتون البلمرة 3D الطباعة من أجهزة زراعة الخلايا العصبية على نطاق صغير

Published: June 7, 2024 doi: 10.3791/66142
Automatic Translation
1, 2, 1
1Neuroscience Department, International School for Advanced Studies, 2Mathematics Department, International School for Advanced Studies

Summary

تتيح الطباعة ثلاثية الأبعاد 3D على مقياس الميكرومتر النماذج الأولية السريعة للأجهزة البوليمرية لمزارع الخلايا العصبية. كدليل على المبدأ ، تم تقييد الروابط الهيكلية بين الخلايا العصبية من خلال إنشاء حواجز وقنوات تؤثر على نمو الخلايا العصبية ، في حين لوحظت العواقب الوظيفية لمثل هذا التلاعب من قبل الفيزيولوجيا الكهربية خارج الخلية.

Abstract

كانت الثقافات العصبية نموذجا تجريبيا مرجعيا لعدة عقود. ومع ذلك ، فإن ترتيب الخلايا 3D ، والقيود المكانية على نمو الخلايا العصبية ، والاتصال المشبكي الواقعي مفقود. هذا الأخير يحد من دراسة البنية والوظيفة في سياق التقسيم ويقلل من أهمية الثقافات في علم الأعصاب. إن تقريب الترتيب التشريحي المنظم للاتصال المشبكي خارج الجسم الحي ليس بالأمر الهين ، على الرغم من كونه مفتاحا لظهور الإيقاعات ، واللدونة المشبكية ، وفي النهاية ، الفيزيولوجيا المرضية للدماغ. هنا ، يتم استخدام بلمرة الفوتون (2PP) كتقنية طباعة ثلاثية الأبعاد ، مما يتيح التصنيع السريع لأجهزة زراعة الخلايا البوليمرية باستخدام polydimethyl-siloxane (PDMS) على مقياس ميكرومتر. بالمقارنة مع تقنيات التشكيل المتماثلة التقليدية القائمة على التصوير الضوئي الدقيق ، تتيح الطباعة على نطاق صغير 2PP تحولا سريعا وبأسعار معقولة للنماذج الأولية. يوضح هذا البروتوكول تصميم وتصنيع أجهزة الموائع الدقيقة القائمة على PDMS والتي تهدف إلى زراعة الشبكات العصبية المعيارية. كدليل على المبدأ ، يتم تقديم جهاز من غرفتين لتقييد الاتصال جسديا. على وجه التحديد ، يفضل النمو المحوري غير المتماثل أثناء التطور خارج الجسم الحي ويسمح بتوجيهه من غرفة إلى أخرى. من أجل التحقيق في العواقب الوظيفية للتفاعلات المشبكية أحادية الاتجاه ، يتم اختيار صفائف الأقطاب الكهربائية الدقيقة التجارية لمراقبة النشاط الكهربائي الحيوي للوحدات العصبية المترابطة. هنا ، يتم توضيح طرق 1) تصنيع القوالب بدقة ميكرومتر و 2) إجراء تسجيلات خارج الخلية متعددة المواقع في المختبر في الثقافات العصبية القشرية للفئران. من خلال خفض التكاليف وإمكانية الوصول إلى الطباعة ثلاثية الأبعاد 2PP في المستقبل ، ستصبح هذه الطريقة أكثر أهمية عبر مختبرات الأبحاث في جميع أنحاء العالم. خاصة في مجال التكنولوجيا العصبية وتسجيل البيانات العصبية عالية الإنتاجية ، فإن سهولة وسرعة النماذج الأولية المبسطة في النماذج المختبرية ستحسن التحكم التجريبي والفهم النظري للأنظمة العصبية واسعة النطاق في الجسم الحي .

Introduction

يمثل التحقيق في النشاط العصبي في الكائنات الحية التي تتصرف العديد من التحديات. على سبيل المثال ، الوصول المادي إلى أنسجة المخ محدود بالحاجة إلى الحفاظ على سلامتها ، لذلك يتم النظر في المناطق السطحية للدماغ بسهولة أكبر. غالبا ما يكون عزل أهداف محددة داخل الأنسجة السليمة مهمة شاقة وأحيانا مستحيلة. على الرغم من أن الثقافات العصبية المتجانسة المنفصلة توفر وصولا سهلا إلى الخصائص الجزيئية والكيميائية الحيوية والفيزيائية الحيوية للمكونات الخلوية الفردية (الفرعية) للدائرة العصبية ، إلا أن الاتصال الواقعي والتنظيم التشريحي للدماغ السليم مفقود. ألهمت هذه القيود الأساسية الجهود البحثية لتحقيق حل وسط ، حيث يتم تجنب التعقيد في الجسم الحي بينما يمكن بناء الهيكل في المختبر ، وهو عند الطلب1،2،3،4،5،6،7،8،9. على وجه الخصوص ، كانت الثقافات العصبية المعيارية موضوع بحث مكثف على مدى العقود الماضية ، بهدف معالجة الأسئلة الرئيسية لفسيولوجيا الدماغ كما هو موضح أدناه.

التنظيم: تظهر الدراسات في الجسم الحي أن الدماغ منظم تشريحيا في طبقات ذات أنواع خلايا دقيقة ومصفوفات من الإسقاطات. كشفت المقايسات الوظيفية عن تنظيم الشبكات العصبية في مجموعات ووحدات العقد ، مع مخططات اتصال دقيقة10,11. ومع ذلك ، لا يمكن دراسة دور الاتصال وزخارف الدوائر الدقيقة بشكل كاف في الجسم الحي بسبب العدد الهائل من نقاط الاشتباك العصبي المعنية ، فضلا عن التأثيرات المتشابكة للتطور واللدونة المعتمدة على النشاط.

نقل الإشارة: في الثقافات في الجسم الحي أو العشوائي في المختبر ، من الصعب تقييم نقل الإشارة. يتطلب فحص التوصيل المحوري وجهد العمل على طوله توجيه نمو الخلايا العصبية عن طريق وظائف السطح أو الزخرفة الكيميائية ، مما يوفر نسبة إشارة إلى ضوضاء عالية في قراءات النشاط الكهربائيخارج الخلية 12.

الصلة الانتقالية: يتطلب فك رموز الدور الحصري للعناصر قبل مقابل ما بعد المشبكي عبر الحالات المرضية الوصول إلى هذه العناصر بشكل فردي. الثقافات المعيارية ذات الاتصال المقيد ، والتي تفصل بشكل فعال العناصر قبل وبعد المشبكي ، هي أدوات لا غنى عنها لتحقيق هذه الغاية13.

توجد عدة طرق للحصول على شكل من أشكال البنية في الثقافة العصبية. يمكن تصنيفها على نطاق واسع على أنها معالجة سطحية كيميائية وفيزيائية9. تعتمد الطرق السابقة 14,15 على ميل الخلايا العصبية للالتصاق ببعض المركبات الكيميائية (الحيوية). وهذا يتطلب ترسيب جزيئات لاصقة أو جذابة على سطح بدقة متناهية الصغر واتباع نمط مفصل. في حين أن هذا يسمح بتغطية جزئية لسطح الخلايا ، باتباع النمط المطلوب ، فإن الطرق الكيميائية محدودة بطبيعتها ولها معدل نجاح منخفض نسبيا في توجيه نمو الخلاياالعصبية 16. يتطلب التحكم الكامل في اتجاه المحور إنشاء تدرج مكاني للمواد الكيميائية المخصصة لتشكيل التوجيه المحوري17. تتضمن الطرق الأخيرة معالجة السطح المادي وتستخدم بشكل أكثر شيوعا لهيكلة الشبكات العصبية في المختبر. يتم تقييد الخلايا العصبية جسديا في المواقع المرغوبة من خلال الحدود الهندسية ، مثل الغرف المجهرية والجدران والقنوات وما إلى ذلك ، مما يشكل بوليمر متوافق حيويا مثل polydimethylsiloxane (PDMS) 3،5،6،7،18،19،20 يتم علاجه وتصلبه في جهاز الموائع الدقيقة. الطريقة الفعلية لتصنيع الموائع الدقيقة PDMS هي الطباعة الحجرية الضوئيةالناعمة 21 ، حيث يتم تصميم قناع ثنائي الأبعاد على نطاق صغير ويستخدم لحفر مادة قائمة على السيليكون بشكل انتقائي عند التعرض للأشعة فوق البنفسجية. باختصار ، يتم طلاء راتنج قابل للمعالجة بالأشعة فوق البنفسجية (أي مقاوم للضوء) على رقاقة سيليكون من خلال طلاء مغزلي ، يصل إلى ارتفاع معين تحدده لزوجته وسرعة دورانه. بعد ذلك ، يتم وضع القناع المنقوش فوق المقاوم للضوء وتعريضه للأشعة فوق البنفسجية. ستسمح المناطق الشفافة داخل القناع ، المقابلة للمناطق ذات الاهتمام ، للأشعة فوق البنفسجية بتحفيز التشابك الموضعي للجزيئات المقاومة للضوء. يتم غسل مناطق مقاومة الضوء غير المكشوفة باستخدام مذيب ، مما يؤدي إلى تكوين قالب رئيسي. يتم استخدام هذا بشكل متكرر لخبز المطاط الصناعي من الاختيار (أي PDMS) ، والذي يتم نقشه بعد ذلك بالأشكال الهندسية المطلوبة في العديد من النسخ المتماثلة حسب الرغبة. طريقة التصنيع هذه هي الطريقة الأكثر شيوعا لتصنيع أجهزة الموائع الدقيقة22. ربما تكون القيود الرئيسية للطباعة الحجرية الضوئية اللينة هي الشرط الأساسي للاستثمار الرأسمالي الملحوظ وعدم إلمام المختبرات البيولوجية بالتقنيات والخبرات المطلوبة. إن تحضير القناع وخطوات الطباعة الحجرية الضوئية الناعمة المطلوبة لتصميم أشكال هندسية معقدة متعددة الارتفاعات ذات نسبة عرض إلى ارتفاع عالية ليست تافهة23 وغالبا ما تتطلب الاستعانة بمصادر خارجية. على الرغم من اقتراح طرق بديلة ومنخفضة الميزانية ، إلا أنها لا تفي دائما بمتطلبات الدقة العالية للنماذج الأوليةالبيولوجية 24.

هنا ، يتم تقديم طريقة تصنيع بديلة ، تعتمد على بلمرة الفوتون (2PP) والتصنيع المضاف. إنه واضح ومباشر ولا يتطلب في حد ذاته خبرة متقدمة في التصنيع الدقيق والتصوير الضوئي. ظهر مجال البحث في التصنيع الدقيق 2PP في أواخر 9025 ، ومنذ ذلك الحين ، شهد نموا هائلا26. يمكن العثور على المزيد حول المبادئ الأساسية لهذه التقنية في مكان آخر26. باختصار ، من خلال تركيز نبضة ضوء الإثارة في الفضاء ثلاثي الأبعاد ، يستفيد 2PP من الاعتماد غير الخطي لامتصاص الفوتون المتعدد على الشدة. وهذا يمنح القدرة على الامتصاص المحصور ، مما يضمن الإثارة الدقيقة والانتقائية داخل المناطق المحلية للغاية. في جوهرها ، تخضع مادة مقاومة ضوئية ذات نغمة سلبية ، وهي مادة ذات قابلية ذوبان منخفضة عند التعرض للضوء ، لحزمة مركزة من نبضات ليزر الفيمتو ثانية في دورة عمل منخفضة27. وهذا يسمح بنبضات ذات كثافة عالية عند متوسط قوى منخفض ، مما يتيح البلمرة دون الإضرار بالمادة. يؤدي تفاعل المونومرات الجذرية المستحثة بالضوء إلى ظهور أوليغومرات جذرية ، مما يؤدي إلى البلمرة التي تمتد في جميع أنحاء المقاومة الضوئية حتى حجم مميز ، أي فوكسل ، الذي يعتمد حجمه على شدة ومدة نبضات الليزر28.

في هذا العمل ، يتم تقديم مكونين: أ) التصميم والتصنيع السريع لقالب مطبوع 3D ، قابل لإعادة الاستخدام عدة مرات لإنتاج أجهزة زراعة الخلايا العصبية البوليمرية التي يمكن التخلص منها (الشكل 1) ، و ب) اقترانها الميكانيكي على سطح ركائز زراعة الخلايا العصبية المستوية ، أو حتى صفائف الأقطاب الكهربائية الدقيقة المدمجة في الركيزة القادرة على تسجيلات متعددة المواقع للإشارات الكهربائية الحيوية.

يتم وصف التصميم بمساعدة الكمبيوتر لنموذج ميكانيكي ثلاثي الأبعاد بإيجاز شديد هنا ويرافقه الخطوات المؤدية إلى قالب مطبوع ثلاثي الأبعاد وتصنيع أجهزة PDMS مفصلة أيضا.

يمكن استخدام مجموعة متنوعة من تطبيقات برامج التصميم بمساعدة الكمبيوتر لإنشاء نموذج كائن 3D للبدء وإنتاج ملف STL للتحكم في عملية طباعة 2PP. ضمن جدول المواد ، يكون التطبيقان الأول والأخير المدرجان مجانيا أو مزودين بترخيص مجاني. يتطلب بناء نموذج 3D دائما إنشاء رسم 2D ، والذي يتم بثقه بعد ذلك في خطوات النمذجة اللاحقة. لإثبات هذا المفهوم ، يتم تمييز عملية تصميم برنامج 3D CAD العامة في قسم البروتوكول ، مما يؤدي إلى هيكل مصنوع من مكعبات متداخلة. للحصول على معلومات أكثر شمولا ، يتوفر عدد من البرامج التعليمية عبر الإنترنت وموارد التدريب المجانية ، كما هو موضح في جدول المواد.

ثم يتم ترجمة ملف STL الناتج إلى سلسلة من الأوامر ليتم تنفيذها بواسطة طابعة 3D (أي إجراء التقطيع). بالنسبة للطابعة 2PP 3D المحددة المستخدمة ، يتم استخدام برنامج DeScribe لاستيراد ملف STL وتحويله إلى تنسيق لغة الكتابة العامة (GWL) الخاص. يتوقف نجاح عملية الطباعة 2PP على معايير مختلفة ، لا سيما طاقة الليزر وسرعة المسح الضوئي والخياطة ومسافات تقطيع الفقس. يعتمد اختيار هذه المعلمات ، إلى جانب اختيار الهدف ومقاومة الضوء ، على أصغر ميزات التصميم ، بالإضافة إلى التطبيق المقصود. وبالتالي ، يصبح تحسين المعلمات ضروريا لتلبية متطلبات سيناريوهات التصميم المختلفة وحالات الاستخدام. لهذا العمل ، تم اعتبار الوصفة الموصى بها IP-S 25x ITO Shell (3D MF) كتكوين لمعلمات الطباعة. في النهاية ، تتم طباعة جزء مطبوع مستقر ميكانيكيا بالدقة اللازمة مع تقليل وقت الطباعة 3D.

يتألف تصميم القالب وملف STL ذي الصلة ، الموضح في هذا العمل ، من إطار مربع لفصل مساحة زراعة الخلايا في جزأين: منطقة خارجية (أي يشار إليها باسم المصدر لاحقا) ومنطقة داخلية (أي يشار إليها باسم الهدف لاحقا). ترتبط هاتان الحجرتان من خلال مجموعات من القنوات الدقيقة ، تتميز كل منها بحدود حادة الزاوية ، مصممة خصيصا لإعاقة نمو الخلايا العصبية من الهدف إلى المصدر ، ولكن ليس العكس ، وبالتالي تعزيز الاتصال المشبكي الاتجاهي بين الخلايا العصبية التي تنمو في المنطقتين.

استخدمت الدراسات السابقة أشكال هندسية مختلفة من القنوات الدقيقة لتشجيع النمو الاتجاهي للخلايا العصبية. ومن الأمثلة على ذلك الأشكال المثلثة18 ، والهياكل الشائكة للقناة19 ، والقنوات المستدقة20. هنا ، يتم استخدام تصميم يتميز بحواجز زاوية حادة عبر حدود القناة الصغيرة ، والتي تتميز أيضا بمداخل غير متماثلة. تعمل هذه القنوات الدقيقة على إنشاء استمرارية بين الجزء الداخلي المغلق ، والمقصورة المستهدفة ، والمنطقة الخارجية ، حجرة المصدر. تم تصميم شكل القمع للجزء الأولي من القنوات الدقيقة ، من جانب المصدر ، لتعزيز تكوين الحزم المحورية ونموها على طول أقصر مسار ، أي خط مستقيم ، يربط المصدر بالهدف. المساحة المثلثة التي تتحقق من خلال مواجهة الزوايا الحادة لها حجم أكبر في الجانب المستهدف بهدف تأخير مسار الأعصاب بشكل فعال مع تفضيل التصوير السريع للحزم الناشئة من المصدر واحتلال المساحة المتاحة. إن اختيار 540 ميكرومتر لطول القنوات الدقيقة يرشح بشكل فعال النمو الشجيري الأقصر بشكل عام39. بالإضافة إلى ذلك ، يمنع ارتفاعها البالغ 5 ميكرومتر الخلية الجسدية من اختراق القنوات الدقيقة. بشكل عام ، أثبت هذا التكوين أنه يعزز الاتصال أحادي الاتجاه بين الوحدات الخارجية والمصدر والداخلية والوحدات المستهدفة ، ويتم تقديمه هنا كدليل على المبدأ من بين العديد من الخيارات البديلة.

في حين أن أجهزة PDMS ، المصنعة بواسطة قالب 2PP ، يمكن توصيلها بسطح ركائز زراعة الخلايا الشائعة ، مثل أغطية الزجاج أو أطباق بتري ، في هذا العمل تم استخدام صفائف الأقطاب الكهربائية الدقيقة المدمجة في الركيزة المتاحة تجاريا. لم يتم بذل أي جهد لتحسين تصميم 3D لتخطيط صفيف microelectrode ، وتم إجراء اقتران ميكانيكي تحت توجيه المجهر المجسم يهدف فقط إلى وضع الجهاز عبر الصفيف ، وترك بعض microelectrode مكشوفة في كلا الجانبين ، المصدر والهدف. وهذا يتيح التقييم الأولي للعواقب الوظيفية للاتصال المقيد في مزارع الخلايا العصبية.

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات المتعلقة بالتعامل مع وفقا للقوانين الأوروبية والإيطالية (توجيه البرلمان الأوروبي والمجلس بتاريخ 22 سبتمبر 2010 [2010/63 / EU] ؛ المرسوم الحكومي الإيطالي الصادر في 4 مارس 2014 ، رقم 26) ، تمت الموافقة عليه صراحة من قبل OpBA المؤسسية (لجنة رعاية) في Scuola Internazionale Superiore di Studi Avanzati وتم تفويضه رسميا من قبل وزارة الصحة الإيطالية (المصادقة رقم 22DAB. N.UVD). أدى ذلك إلى توافر مواد غير حساسة من أنسجة دماغ الفئران المزروعة ، لاستخدامها في التحقق التجريبي من الطريقة المقدمة في هذا العمل.

تصنيع 1. 3D القوالب عن طريق بلمرة الفوتون

  1. إنشاء ملفات CAD
    ملاحظة: توضح الخطوات التالية سير عمل تصميم 3D عام ، باستخدام برنامج تصميم بمساعدة الكمبيوتر (أي SolidWorks). ونموذج ملف تصميم المحكمة الخاصة بلبنان الموصوف في هذا العمل (الشكل 2) متاح كملف ترميز تكميلي 1، وكذلك من خلال Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8222110).
    1. قم بتشغيل تطبيق سطح المكتب لبرنامج التصميم بمساعدة الكمبيوتر. من شريط القائمة العلوي، حدد جديد.
    2. من الخيارات ، اختر جزء: تمثيل 3D لمكون تصميم واحد. اضغط على تركيبة المفاتيح Ctrl + 5 لإنشاء العرض العلوي للرسم.
    3. من اللوحة الجانبية، حدد رسم واختر مستطيل زاوية. حدد حافة واحدة من المستطيل بالنقر فوقها. عند ظهور لوحة معلمات، اضبط الطول على 100 وحدة.
    4. كرر الخطوة 1.1.3 للحافة المتعامدة مع الحافة السابقة: اضبط طولها على 50 وحدة. حدد المستطيل عن طريق السحب فوقه أثناء الضغط على زر الماوس الأيسر.
    5. من القائمة إضافة علاقة ، حدد إصلاح، لتقييد العلاقات بين الأسطر.
    6. اخرج من الرسم وكرر الخطوات من 1.1.3 إلى 1.1.5 ، مع إنشاء مستطيل جديد (أصغر) ، متداخل مع الرسم السابق.
    7. من اللوحة الجانبية، حدد الميزات، واختر Extruded Boss/Base: اضبط عمق كل من المستطيلات الكبيرة والصغيرة على 5 و 10 وحدة، على التوالي.
    8. من القائمة ملف ، احفظ الجزء بتنسيق STL (أي لغة الفسيفساء القياسية).
  2. معالجة ملفات CAD
    1. نقل ملف STL إلى جهاز كمبيوتر شخصي مزود ببرنامج تطبيق DeScribe.
    2. قم بتشغيل الوصف ومن قائمة "ملف" ، افتح ملف STL. سيظهر تمثيل 3D للنموذج.
    3. من قسم الاتجاه في القائمة الموجودة على الجانب الأيمن ، قم بتدوير النموذج لتوجيهه بشكل مناسب في الفضاء ، وقم بتوسيطه في المستوى.
    4. اضبط القياس الكلي عن طريق تحديد قسم القياس في القائمة الموجودة على الجانب الأيمن.
    5. من القائمة المنسدلة في الأعلى ، حدد وصفة IP-S 25x ITO Shell (3D MF). يحدد هذا IP-S على أنه مقاوم للضوء ، 25x لقوة التكبير للهدف ، الركيزة المطلية بأكسيد القصدير الإنديوم (ITO) كركيزة طباعة ، وطباعة الغلاف والسقالة كوضع تشغيل مع ميزات متوسطة الحجم (MF).
    6. تنقل عبر المعالج ، وحدد وضبط مسافة التقطيع إلى 1 ميكرومتر ومسافة الفقس إلى 0.5 ميكرومتر لكل من الغلاف والسقالة.
    7. في خطوة الإخراج لمعالج الاستيراد ، ضمن التقسيم ، حدد حجم الكتلة ك X = 200 μm و Y = 200 μm و Z = 265 μm وإزاحة الكتلة ك X = 133 μm و Y = 133 μm و Z = 0 ، مما يضمن عدم تأثر الهياكل الدقيقة للقنوات الدقيقة بخطوط الخياطة.
    8. كوضع مسح ضوئي ، استخدم الافتراضي: Galvo لمستوى X-Y و Piezo للمحور Z.
    9. اضغط على حفظ ، وفي القائمة النصية التالية ، استبدل السطر var $baseLaserPower = $shellLaserPower ب var $baseLaserPower = 75 ، لتقليل طاقة الليزر عند أدنى طبقة من الطباعة إلى 75٪.
    10. انقل ملفات GWL التي تم الحصول عليها من خلال الخطوات المذكورة أعلاه إلى محطة العمل المخصصة لطباعة 2PP 3D.
  3. 3D الطباعة وتطوير عينة
    1. قم بتشغيل برنامج تطبيق NanoWrite . بعد تهيئة الطابعة ، انقر فوق Exchange Holder على واجهة البرنامج ، لإدخال حامل الركيزة وتركيب الهدف.
    2. قم بتثبيت الهدف 25x في الموضع المناسب على قطعة الأنف. حدد أي جانب من الركيزة الزجاجية مطلي ب ITO ، بواسطة مقياس إلكتروني متعدد تم ضبطه لقياس المقاومة: يجب أن تكون القراءة قيما منخفضة ، مثل 100-300 Ω ، ولكن فقط للجانب المطلي ب ITO.
    3. ضع الركيزة الزجاجية على الحامل ، مع توجيه الجانب المطلي ب ITO لأعلى. استخدم الشريط لتثبيته بإحكام في مكانه.
    4. تحت غطاء الدخان الكيميائي ، ضع قطرة من مقاومة الضوء IP-S في وسط الركيزة الزجاجية.
    5. أدخل الحامل في طابعة 3D ، بحيث يكون انخفاض الراتنج مواجها للهدف (أي لأسفل).
    6. من خلال قائمة ملف البرنامج ، قم بتحميل ملفات GWL. حدد نموذج النهج، لنقل الهدف بالقرب من قطرة الراتنج.
    7. حدد Find Interface للسماح باكتشاف واجهة الطباعة المقاومة للضوء ITO، بناء على اختلاف معامل الانكسار للمادتين.
    8. حدد بدء العمل لبدء الطباعة. عند انتهاء الطباعة، اضغط على Exchange Holder لاسترداد الحامل.
    9. استرجع الحامل وقم بإزالة الركيزة برفق باستخدام الجزء المطبوع. اغمر الركيزة الزجاجية في أسيتات البروبيلين غليكول ميثيل الأثير (PGMEA) لمدة 20 دقيقة تحت غطاء الدخان ، لتطوير الجزء المطبوع.
    10. قم بإزالة الركيزة من PGMEA واغمرها في الأيزوبروبانول لمدة 5 دقائق. اترك الجزء المطبوع يجف في الهواء ، تحت غطاء الدخان الكيميائي.
  4. معالجة ما بعد الطباعة وتركيب القالب
    1. عالج الجزء المطبوع عن طريق التعرض للأشعة فوق البنفسجية (أي 365-405 نانومتر) بطاقة كافية لمدة 5-20 دقيقة (انظر المناقشة للحصول على تفاصيل الطاقة).
    2. تحت غطاء التدفق الصفحي ، قم بإزالة الجزء المطبوع برفق من الركيزة الزجاجية. إسقاط ~ 2 ميكرولتر من الراتنج إلى أسفل طبق بتري 35 مم × 10 مم.
    3. ضع الجزء المطبوع بعناية فوق القطرة واترك الراتنج يتدفق أسفل الجزء. مزيد من علاج الجزء المطبوع عن طريق التعرض للأشعة فوق البنفسجية ، لمدة 5 دقائق.
    4. غطي طبق بتري بغطاءه وانقله إلى الفرن للمعالجة الحرارية ، على مدى 30 دقيقة عند 80 درجة مئوية. لا تقم بتسخين الفرن مسبقا لتجنب تشوه أو كسر الجزء المطبوع. بعد المعالجة ، سيتم إرفاق الجزء المطبوع بشكل دائم بأسفل طبق بتري. من الآن فصاعدا ، سيشار إلى الجزء المطبوع والمركب باسم القالب.

2. تصنيع جهاز PDMS من ركائز القالب وزراعة الخلايا

  1. تصنيع جهاز PDMS
    1. تحضير 20 مل من خليط 10: 1 (نسبة الوزن) من القاعدةوعامل المعالجة ل PDMS غير المبلمر. لكل جهاز ، واعتمادا على ارتفاعه المطلوب ، يكفي 1-2 مل من خليط PDMS. قم بتخزين PDMS الزائد غير المبلمر عند -20 درجة مئوية للاستخدام لاحقا.
    2. تحت غطاء التدفق الصفحي ، حرك الخليط جيدا لمدة 4 دقائق. عندما يحبس الخليط فقاعات الهواء بالتساوي ، سيصبح معتما.
    3. انقل الخليط إلى أنبوب 50 ميكرولتر وطرده مركزيا عند 168 × جم لمدة 5 دقائق ، للتخلص من فقاعات الهواء من الخليط وتحقيق مظهر واضح.
    4. عالج القالب ب 10 ميكرولتر من عامل مسعور (أي Repel-silane ES) واتركه يرتاح لمدة 7 دقائق ، مما يضمن انفصالا سلسا ل PDMS المبلمر عن القالب لاحقا.
    5. شطف القالب 1x مع 70 ٪ من الإيثانول ، و 2x مع الماء منزوع الأيونات (DI). اترك القالب يجف في الهواء تحت غطاء التدفق الصفحي.
    6. صب خليط PDMS برفق على القالب ، حتى يتم الوصول إلى الارتفاع النهائي المقصود للجهاز. لمنع تكوين فقاعات الهواء ، صب الخليط برفق ومن مسافة قريبة من سطح القالب.
    7. غطي القالب وانقله لمدة 18 دقيقة إلى فرن تم تسخينه مسبقا واستقراره عند 80 درجة مئوية للمعالجة. بالنسبة لارتفاعات الجهاز التي تزيد عن 5 مم وحتى 1 سم ، قم بتمديد وقت المعالجة من 18 إلى 25 دقيقة.
    8. تحت غطاء التدفق الصفحي ، افصل كتلة PDMS المعالجة برفق عن القالب واغمرها في الأيزوبروبانول لمدة 10 دقائق على الأقل ، داخل طبق بتري زجاجي. الأيزوبروبانول يزيل PDMS غير المتشابك. احتفظ دائما بكتلة PDMS مغطاة.
    9. قم بتجديد الأيزوبروبانول ، وتحت مجهر ستيريو ، قم بقطع القسم المربع المركزي للجهاز بعناية (تم تحديده على أنه المنطقة المستهدفة ، في هذا العمل) بواسطة سكين طعنة عينية. بعد ذلك ، تابع إجراء مزيد من القطع على طول الحواف لتحقيق الشكل النهائي للجهاز.
    10. استرجع الجهاز من الأيزوبروبانول واغمره في الإيثانول لمدة 30 دقيقة ، ثم اشطفه 3 مرات بماء DI المعقم. الحفاظ على العقم من هذه النقطة فصاعدا.
    11. تحت غطاء التدفق الصفحي ، انقل الجهاز إلى طبق بتري جديد ، تاركا غطاءه مفتوحا قليلا. اتركه يجف تماما في الهواء.
  2. تركيب الجهاز وإعداد ركائز زراعة الخلايا.
    1. قم بتعقيم كل صفائف أقطاب كهربائية دقيقة (MEAs) عن طريق غمرها في 70٪ من الإيثانول لمدة 30 دقيقة ، ثم شطفها 3 مرات بماء DI المعقم.
    2. باستخدام ملاقط دقيقة معقمة ، تحت غطاء التدفق الصفحي والمجهر المجسم ، قم بتركيب جهاز PDMS على المنطقة الداخلية من MEA. قم بمحاذاة جانب واحد من جهاز PDMS إلى مركز منطقة MEA الداخلية ، والتي تتميز بأقطاب كهربائية دقيقة مدمجة بالركيزة ، بحيث يتم ترك عدد قليل من الأقطاب الكهربائية الدقيقة غير مغطاة من كل من مناطق المصدر والهدف (انظر الشكل 2).
      ملاحظة: لهذا العمل ، ليس من الضروري محاذاة الأقطاب الكهربائية الدقيقة MEA مع القناة الدقيقة لجهاز PDMS. قد تكون هناك حاجة إلى ضغط لطيف على الجهاز لتحقيق ختم محكم بين جهاز PDMS وسطح MEA. تجنب بأي ثمن لمس الأقطاب الكهربائية الدقيقة من طرف الملقط.
    3. أدخل MEA مع جهاز PDMS عليه في غرفة تنظيف البلازما ، لتنشيط تنشيط السطح من خلال بلازما الهواء. ابدأ العملية بإخلاء مضخة تفريغ لمدة 4 دقائق من الغرفة. بعد ذلك ، افتح صمام الهواء قليلا للسماح بنزيف الهواء المتحكم فيه. أغلق صمام الهواء وقم بتشغيل محرضات البلازما ، واضبط مستوى طاقة التردد اللاسلكي بين 10 واط و 18 واط.
    4. بمجرد ظهور ضوء متوهج ، دع العملية تعمل لمدة 80 ثانية. بعد ذلك ، قم بإيقاف تشغيل محفز البلازما ، وأغلق صمام مضخة التفريغ ، وافتح صمام الهواء برفق. افتح الغرفة لاسترداد MEA.
      ملاحظة: إذا كان العلاج بالبلازما ينطوي على تعريض MEAs لبيئة غير معقمة ، ضع كل MEA تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية في غطاء التدفق الصفحي لمدة 30 دقيقة ، لضمان العقم.
    5. أضف 1 مل من محلول البولي إيثيلين (PEI) 0.1٪ بالوزن / المجلد إلى MEA واحتضانه عند 37 درجة مئوية طوال الليل. نضح محلول PEI واشطفه بماء DI المعقم 5x. أضف 1 مل من وسط زراعة الخلايا إلى MEA واحتضانه قبل بذر الخلية.

3. زراعة الخلايا العصبية والفيزيولوجيا الكهربية

  1. تحضير مقدما وسط التشريح ، محلول الهضم ، والحلول 1-3 (انظر الجدول 1).
  2. ثقافة الخلايا العصبية المنفصلة.
    1. أمسك برفق جرو فأر Wistar الوليدي الذي يبلغ من العمر 0-1 يوما بواسطة الخطم وقم بإجراء قطع رأس سريع باستخدام مقص حاد.
    2. قم بتقشير جلد فروة الرأس ، وقم بعمل شق على طول خط الوسط السهمي للجمجمة باستخدام مقص ناعم ، ثم قم بعمل قطع إكليلي عبر الجمجمة عند تقاطع المخيخ.
    3. قم بإزالة الجمجمة ، واستخرج الدماغ بملعقة دقيقة وانقلها إلى وسط تشريح بارد (4 درجات مئوية).
    4. إزالة الأنسجة تحت القشرية ، الحصين ، والسحايا. فرم الأنسجة إلى قطع صغيرة (أي 1-2 مم3) وانقلها في أنبوب سعة 15 مل. تخلص من المحلول واشطف الأنسجة باستخدام وسيط تشريح جديد ، متبوعا بغسل بوسط الهضم.
    5. تخلص من وسط الهضم ، ثم أضف 1 مل من المحلول 1. احتضان الخليط على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. تجاهل الحل 1 وشطف الأنسجة مع وسط تشريح جديد. ثم أضف 1 مل من المحلول 2 واحتفظ بالمزيج لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    6. تخلص من المحلول 2 واشطف الأنسجة باستخدام وسيط تشريح جديد. ثم أضف 1 مل من المحلول 3. قم بفصل الخلايا ميكانيكيا عن طريق سحب المحلول ببطء لأعلى ولأسفل من 20 إلى 30 مرة. عندما يظهر خليط عكر موحد من الخلايا المنفصلة ، ارفع حجمه إلى 3 مل عن طريق إضافة وسط تشريح.
    7. اجمع حبيبات الخلية عن طريق الطرد المركزي للخليط عند 100 × جم لمدة 5 دقائق. نضح المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من وسط الاستزراع المسخن مسبقا.
    8. عد الخلايا (أي بواسطة غرفة عد الخلايا) واضبط كثافة محلول بذر الخلية وفقا لذلك.
    9. قم بزرع كل MEA ب 1 مل من محلول البذر بكثافة خلية اسمية تبلغ 1.8 × 106 (~ 6500 خلية / مم2). احتضان MEAs البذور في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. تبادل الوسيلة مع وسيط ثقافة جديدة (أي أسبوعية) كل 2 أيام.
  3. الفيزيولوجيا الكهربية خارج الخلية
    ملاحظة: تصل مزارع الخلايا العصبية المنفصلة إلى نمط ظاهري كهربائي ناضج تماما بعد 2-3 أسابيع في المختبر. تصف الأقسام التالية بروتوكول التحفيز خارج الخلية باستخدام برنامج تطبيقي تجاري MEA (Experimenter) لتحفيز أي من المجموعات العصبية المستزرعة في وحدات ، أي المصدر أو الهدف ، مع تسجيل نشاط كلا المجموعتين في نفس الوقت ، في الشبكات الناضجة.
    1. قم بتركيب MEA واحد برفق داخل مقدمة مكبر الصوت الإلكتروني متعدد القنوات ، داخل حاضنة جافة (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2) واتركه يستوعب لمدة 10 دقائق. يمكن تصنيع غطاء PDMS مخصص بشكل منفصل واستخدامه كغطاء محكم لكل MEA ، لتقليل تبخر الماء والحفاظ على العقم.
    2. قم بتشغيل برنامج المجرب. اضبط معدل أخذ العينات على 25 كيلو هرتز وابدأ الحصول على البيانات بالضغط على Start DAQ. في لوحة عرض البيانات، تظهر الآثار الأولية للنشاط المسجل خارج الخلية لكل قناة.
    3. راقب النشاط التلقائي وحدد بصريا وحدد 3 أزواج من الأقطاب الكهربائية الدقيقة المجاورة التي تنشط أثناء رشقات نارية من رشقات النشاط المتزامن التلقائي على مستوى الشبكة ، إما من الأقطاب الكهربائية الدقيقة من جانب المصدر أو الهدف.
    4. في لوحة التحفيز الخاصة بالبرنامج ، قم بتكوين المعلمات لكل زوج من أزواج الأقطاب الكهربائية الدقيقة المحفزة في التكوين ثنائي القطب: حدد شكل موجة نبضة ثنائية الطور واضبط سعة الذروة على ± 800 مللي فولت ، ومدة النبضة إلى 200 ميكرو ثانية.
    5. اضبط المسجل وسجل لمدة 300 مللي ثانية قبل 1000 مللي ثانية بعد التحفيز.
    6. كرر الخطوات من 3.3.3 إلى 3.3.5 للجانب المصدر والهدف بطريقة متداخلة للعدد المطلوب من التكرار.

Representative Results

تم الإبلاغ هنا عن تصنيع جهاز زراعة الخلايا البوليمرية (العصبية) المكون من حجرتين ، مما يجسد استخدام الطباعة ثلاثية الأبعاد 2PP للنماذج الأولية السريعة لأجهزة PDMS. على وجه التحديد ، يتم إنتاج جهاز للشبكات العصبية المعيارية ذات الاتصال المشبكي أحادي الاتجاه ويتم تقديم توصيفه الوظيفي من حيث الفيزيولوجيا الكهربية خارج الخلية متعددة المواقع. باختصار ، تم تحقيق قالب مقياس ميكرومتر عن طريق الكتابة بالليزر المباشر ، باستخدام طابعة 3D المتاحة تجاريا. على وجه الخصوص ، توفر الطابعة طاقة تبلغ 50 ميجاوات من خلال نبضات الليزر بطول موجي مركزي يبلغ 780 نانومتر ومدة تتراوح من 80 إلى 100 fs. أثناء عملية التصنيع ، يتم تركيز شعاع الليزر من خلال الهدف (25x ، NA = 0.8) للطابعة على مقاومة الضوء ذات اللون السلبي (IP-S) لمسح حجم الطباعة باستخدام الماسح الضوئي galvo للمحاور x و y ، ومرحلة بيزو للمحور z. تم تقسيم حجم الطباعة بشكل مناسب إلى كتل 200 مم × 200 مم × 265 مم لتحقيق قالب بحجم إجمالي 6500 مم × 6500 مم × 545 مم وحجم اسمي 12.423 مل. يمثل الشكل 2A رسما ثنائي الأبعاد للقالب ، مع إبراز أبعاده وحجم ميزاته ، بينما يوضح الشكل 2B صورة عن قرب للجهاز النهائي المثبت على MEA. كانت القوالب المحضرة كما هو موضح في القسم السابق متينة ويمكن إعادة استخدامها أكثر من 50 مرة لتصنيع أجهزة PDMS.

تم استخدام القالب المطبوع لصب جهاز PDMS ، والذي تم تركيبه بعد ذلك على المنطقة الداخلية للمصفوفات المدمجة ذات الركيزة الزجاجية لمصفوفات الأقطاب الكهربائية الدقيقة (MEA) ، لاستخدامها في التسجيلات خارج الخلية متعددة المواقع للنشاط الكهربائي العصبي وكدليل على المبدأ. تم استخدام MEAs التجارية المتكاملة للركائز لمراقبة نشاط الثقافات المعيارية استجابة للمحفزات الكهربائية الموضعية مكانيا التي يتم توصيلها خارج الخلية بواسطة مجموعة فرعية من microelecrode الموجودة في كل حجرة استزراع. يحتوي كل MEA على 120 قطبا كهربائيا دقيقا من نترات التيتانيوم (TiN) بقطر 30 ميكرومتر و 100 ميكرومتر بين الأقطاب الكهربائية. يوضح الشكل 2C-D موضع جهاز PDMS أعلى MEA. تؤدي السمات الهندسية للقنوات الدقيقة الفردية للجهاز جنبا إلى جنب مع البصمة الكلية للغرفة الموضحة في الشكل 2C إلى تجزئة الخلايا العصبية المستزرعة. يمكن تمييزها بناء على المقصورة التي تنتمي إليها ، في المنطقة الخارجية (المصدر) للجهاز ، أو في المنطقة الداخلية (الهدف) للجهاز. يتم تحديد التوجيه المحوري المفضل ، المقيد من المصدر إلى الهدف ، من خلال الحواف ذات الزاوية الحادة للقنوات الدقيقة. يوضح الشكل 2D وضع الجهاز البوليمري على MEA ومنطقة التغطية النسبية لأقطاب التسجيل الموجودة داخل مقصورات المصدر أو الهدف. لاحظ أن المحاذاة الدقيقة للقنوات الدقيقة للجهاز داخل صف واحد أو أكثر من الأقطاب الكهربائية الدقيقة MEA لم تكن مطلوبة لدراسة الحالة الخاصة بنا ولم تتم متابعتها.

يتم تقديم دليل تمثيلي على نمو الخلايا العصبية غير المتماثلة في الشكل 3 ، أثناء التطور خارج الجسم الحي ، مما يدل على الخلايا العصبية الموسومة بالفلورسنت في التصوير الحي ، 6 أيام (الشكل 3 أ) و 2 أيام بعد طلاء الخلية (الشكل 3B-D). بينما واجهت الخلايا العصبية الموجودة على الجانب المستهدف من الجهاز حواجز زاوية حادة كعقبات تعيق تقدمها عبر الفضاء ، نمت الخلايا العصبية الناشئة من جانب المصدر دون انقطاع وعبرت القنوات. يفضل عدم التماثل هذا اتصالا محوريا أحادي الاتجاه بين الخلايا العصبية في الجزأين ، وإسقاط من المصدر إلى الهدف ، كما هو مقصود صراحة من التصميم. يتم دعم هذه النتيجة أيضا من خلال تقييم فسيولوجي كهربي (وظيفي) للاستجابات الكهربائية التي تثيرها المنبهات التي يتم تسليمها بدلا من ذلك في كل من المقصورتين.

بعد 3-4 أسابيع في المختبر ، حيث وصلت الشبكات العصبية إلى مرحلة النضج الكامل29,30 ، يمكن فحص الاتصال الوظيفي عبر الجزأين عند تقديم محفزات كهربائية قصيرة ومراقبة الاستجابات العصبية التي أثارتها31. ثم تم تطبيق النبضات الكهربائية ثنائية الطور بسعة 800 mV بدلا من ذلك فقط على المصدر أو فقط على السكان المستهدفين (تكرار N = 150 ، N الثقافات المعيارية = 6) ، يتم تسليمها بواسطة 3 أزواج متجاورة من الأقطاب الدقيقة المستوية في تكوين ثنائي القطب ، وبطريقة متشابكة. لذلك ، يمكن وضع 3 أزواج من الأقطاب الكهربائية داخل منطقة المصدر في MEA أو داخل المنطقة المستهدفة من MEA. يمكن بعد ذلك اكتشاف الاستجابات الكهربائية التي يثيرها كل حافز بواسطة جميع الأقطاب الكهربائية الدقيقة MEA بعد تأخير الانتشار. وأجريت التسجيلات بمعدل أخذ عينات قدره kHz 25/channel، وتمت رقمنة الإشارات الكهربائية الخام خارج الخلية الناتجة بدقة تحويل تناظرية إلى رقمية تبلغ 16 بتة. تم استخدام خوارزمية اكتشاف عتبة عبورالذروة 32 في وضع عدم الاتصال للكشف عن وقت حدوث إمكانات الفعل خارج الخلية ، دون إجراء أي فرز سبايك. يكشف الشكل 4A-B بوضوح عن عدم تناسق قوي للاستجابات المستثارة ، والتي تتكرر 150 مرة ، اعتمادا على موقع تسليم التحفيز ، مما يشير إلى تأثير وظيفي كبير للقيود الهندسية على الاتجاه المفضل للاتصال. في الواقع ، عند تحفيز جانب المصدر ، زاد معدل إطلاق الخلايا العصبية المصدر - المقدر بحساب الرسم البياني لارتفاع التحفيز المحيط - كما هو متوقع مما أدى إلى توليد انفجار كامل للشبكة من إمكانات العمل33،31،34 وتبعه ، بعد تأخير ، زيادة في معدل إطلاق النار للسكان المستهدفين. ومع ذلك ، نظرا لأن التحفيز تم تسليمه داخل السكان المستهدفين ، فقد زاد معدل إطلاق النار فقط للسكان المستهدفين مع بقاء سكان المصدر صامتين في الغالب. يكرر الشكل 4C-D نفس نموذج التحفيز / الاستجابة في ثقافة التحكم ، مع عدم وجود جهاز بوليمري (أي ثقافة عصبية غير منظمة) ، كما تم تسليم المحفزات خارج الخلية على مدار 4 تكرارات. بالنسبة لظروف التحكم هذه ، لم يحدث أي عدم تناسق في الاستجابات التي أثارها أي من الحافز. في حين أن المجموعة الفرعية من الأقطاب الكهربائية الدقيقة MEA المستخدمة لتوصيل المحفزات تتطابق مع تلك المستخدمة في الشبكات المعيارية ، أدى موقع توصيل التحفيز إلى استجابة مماثلة من جميع السكان. هذا يؤكد أن جهاز PDMS يفضل الاتصال المشبكي أحادي الاتجاه ، عبر المقصورتين. بشكل عام ، تشير الاستجابات غير المتماثلة التي يتم استحضارها في الثقافات المعيارية (N = 6) والاستجابات المتماثلة التي يتم استثارتها في الثقافات الضابطة (N = 4) بقوة إلى اتصال تشريحي مقيد لنظام مجزأ في المختبر. يتم توفير البيانات الفيزيولوجية الكهربية والنصوص المستخدمة لتوليد الشكل 4 من خلال Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8220990).

Figure 1
الشكل 1: رسم تخطيطي لتصنيع القوالب الدقيقة 2PP وقولبة النسخ المتماثلة PDMS. (أ) تم تصميم نموذج ثلاثي الأبعاد بلغة CAD وتم تصديره بتنسيق لغة الفسيفساء القياسية (STL) ، (ب) توجيه الطباعة ثلاثية الأبعاد 2 فوتون من خلال البلمرة المستحثة بالليزر داخل قطرة من الراتنج (IP-S). (ج) يتم استخدام الهيكل الناتج كقالب للتصنيع المتكرر للنسخ المتماثلة PDMS. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: مثال على النماذج الأولية السريعة الداخلية لجهاز PDMS لزراعة الخلايا البوليمرية (العصبية). (أ) في أقل من 24 ساعة ، يسمح التصنيع الإضافي على نطاق صغير بالانتقال من نموذج CAD إلى سيد مطبوع 3D ، ليتم استخدامه على الفور ، وبشكل متكرر ، كقالب متماثل مع اللدائن المتوافقة حيويا ، مثل PDMS. (ب-ج) تقترن أجهزة PDMS الناتجة بركيزة مستوية لثقافة الخلايا العصبية ، ممثلة هنا بمجموعة من الأقطاب الكهربائية الدقيقة. بالنسبة لتصميم العينة المحدد في (A) ، يتم تعريف غرفتين: واحدة يشار إليها باسم المصدر ويشار إليها بواسطة S ، والأخرى يشار إليها باسم الهدف ويشار إليها بواسطة T. (D) لا يمكن للخلايا العصبية المطلية في كل غرفة أن تنمو عصاياها العصبية إلا من خلال سلسلة من القنوات الدقيقة. عند المحاذاة بشكل مناسب تحت توجيه المجهر المجسم في (C) ، يتم ترك مجموعتين من الأقطاب الكهربائية الدقيقة المدمجة في الركيزة مكشوفة ، بحيث يمكن تحفيز النشاط الكهربائي الحيوي للخلايا العصبية القريبة الموجودة في كلا الجزأين وتسجيله. لاحظ هنا أن محاذاة الأقطاب الكهربائية الدقيقة داخل القنوات الدقيقة الفردية لم تكن أولوية إثبات المبدأ هذا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: التصوير الحي لجزيئات مراسل الفلورسنت غير المشبعة بالخلايا ، يحدد الخلايا العصبية التي تستطيدها الخلايا العصبية ، بعد أيام قليلة من طلاء الخلية. (أ-د) تم الحصول على صور مجهرية مضان متحدة البؤر تمثيلية للثقافات العصبية المعيارية للجهاز المصنعة من الشكل 1 والشكل 2 (N = 4،128 قناة دقيقة فردية) بعد يومين و 6 أيام من طلاء الخلايا. (ب-د) تكبير 40x ومقياس رمادي مقلوب للصور المجهرية لزيادة الرؤية. يشار إلى نهايات القنوات الدقيقة من مقصورات المصدر والهدف بواسطة S و T ، على التوالي. (A) يظهر صورة المسح الواسع للثقافة ، حيث يمتلئ المصدر (أي المنطقة المربعة الداخلية) والهدف (أي المنطقة الخارجية) بالخلايا ، بعد 6 أيام من الطلاء. (B) و (C) يعرضان ، في وقت سابق من 2 أيام بعد الطلاء ، نمو الخلايا العصبية في المصدر وعلى الجانبين المستهدفين للقنوات الدقيقة ، على التوالي. تشير المثلثات السوداء الصغيرة إلى أمثلة تمثيلية لأطراف الحزم المحورية المفترضة ، والتي يبدو أنها نشأت فقط من المصدر. تشير حدود القنوات الدقيقة على شكل سهم إلى استطالة الخلايا العصبية على طول الحافة (B) ، حيث يتم عدم انقطاع مرورها وتوجيهها نحو الهدف. في الاتجاه المعاكس ، وبجانب نهاية الهدف لقناة صغيرة (C) ، يتم احتجاز الخلايا العصبية الناشئة من الهدف والتقدم إلى جانب المصدر في الزوايا الحادة. (د) يكشف كذلك عن تفاصيل نمو الخلايا العصبية داخل قناة دقيقة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: التوصيف الوظيفي للاستجابات الكهربائية للخلايا العصبية ، مع أو بدون جهاز PDMS. تم استخدام MEAs كركائز لزراعة الخلايا واستخدمت لقياس استجابات الارتفاع على مستوى الشبكة التي أثارتها نبضة تحفيز كهربائي ثنائية الطور قصيرة جدا (أي 200 ميكروثانية ، 0.8 فولت) ، يتم تسليمها في تكوين ثنائي القطب. باستخدام جهاز PDMS في الشكل 2 ، تختلف استجابات ارتفاع الخلايا العصبية المسجلة من المصدر (الأحمر) ومن الهدف (الأزرق) ، اعتمادا على مكان توصيل التحفيز. تصبح التأخيرات المحورية والمشبكية والتكاملية المفترضة واضحة في (A) ولكن ليس في (B) ، مما يشير إلى وجود اتصال متشابك مفضل (أي من المصدر إلى الهدف). (ج-د) في ظل ظروف التحكم (أي مع عدم وجود جهاز PDMS) ، لا تعتمد الاستجابات المثارة المكتشفة في مجموعتين متميزتين من الأقطاب الكهربائية الدقيقة MEA على موقع توصيل التحفيز. يشير التظليل ذو اللون الشاحب ، الذي يلف الخطوط في المؤامرات ، إلى الخطأ المعياري الفوري للمتوسط (N stimuli = 150). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

اسم الحل تكوين
البولي إيثيلين (PEI) 0.1٪ 1 مل من محلول مخزون PEI ، 9 مل من الماء منزوع الأيونات المعقم (DI).
وسط استزراع (50 مل) الحد الأدنى من الوسط الأساسي (MEM) ، مكمل ب 20 ميكرومتر جلوكوز ، 50 ميكروغرام / مل جنتاميسين ، 50 ميكرومتر ل-جلوتامين ، و 10٪ مصل حصان معطل بالحرارة.
وسط تشريح (1000 مل) أملاح هانكس المتوازنة 9.52 جم، بيكربونات الصوديوم 350 مجم، HEPES 2.83 جم، D- (+) -جلوكوز 6 جم، حمض الكينورينيك (التركيز النهائي 200 ميكرومتر)، D-AP5 (التركيز النهائي 25 ميكرومتر)، جنتاميسين 250 ميكرولتر، مصل البقري الزلال 300 ملغ، كبريتات المغنيسيوم 1.44 غرام. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.3 ، واحفظه بعيدا عن الضوء وخزنه عند 4 درجات مئوية.
وسط الهضم (100 مل) كلوريد الصوديوم 800 ملغ ، كلوريد البوتاسيوم 37 ملغ ، فوسفات الهيدروجين ثنائي الصوديوم 99 ملغ ، HEPES 600 ملغ ، بيكربونات الصوديوم 35 ملغ ، حمض الكينورينيك ، 200 ميكرولتر (من مخزون 100 mM) ، D-AP5 100 ميكرولتر (من المخزون 25 mM). اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4 ، واحفظه بعيدا عن الضوء واحفظه عند 4 درجات مئوية.
الحل 1 التربسين 5 ملغ ، ديوكسي ريبونوكلياز I 1.5 ملغ ، في 2 مل من وسط الهضم.
الحل 2 مثبطات التربسين 5 ملغ ، في 5 مل من وسط التشريح.
الحل 3 ديوكسي ريبونوكلياز I 1.5 غرام ، في 2.5 مل من وسط التشريح.

الجدول 1: جدول الحلول. راجع جدول المواد للحصول على أوصاف المنتج.

ملف الترميز التكميلي 1: يتوافق ملف تصميم STL مع الهيكل الموضح في الشكل 2A. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Discussion

على الرغم من كونه عمره عقودا ، إلا أن تطبيق تقنية 2PP في قولبة النسخ المتماثلة القائمة على PDMS على نطاق ميكرومتر هو تطور حديث43,44. وفي هذا السياق، تناقش أدناه سلسلة من النقاط لمساعدة المستخدمين على استنساخ هذا العمل بفعالية.

لتصميم نموذج 3D ، تأكد من أن النموذج لا يحتوي على ثقوب أو تقاطعات ذاتية. قم بامتياز تنسيق الملف الثنائي عند الحفظ بتنسيق STL ، لحجم ملفه الأصغر من ترميز ASCII. هذا مفيد بشكل خاص للتصميمات ذات الأشكال الهندسية المعقدة وللكائنات ذات العرض المليلتر. استخدام ملفات STL الثنائية يعني أيضا انخفاض تحميل وحدة المعالجة المركزية، في وقت لاحق في عملية إعداد الجزء الميكانيكي ليتم طباعتها 3D. يتم تمثيل الأبعاد المادية للميزات داخل ملف STL في وحدات بلا أبعاد. أثناء المعالجة اللاحقة لملف STL ، يتم تفسير الوحدات على أنها ميكرومتر. لذلك ، يوصى باعتماد وحدة الاهتمام مقدما ، أي ميكرومتر ، عند إعداد الملف. يتم تحديد دقة النموذج المطبوع من خلال عدد الأسطح التي تقترب من المثلثات الفسيفسائية. بالنسبة لعدد غير كاف من الأسطح ، ستظهر خشونة سطح غير مرغوب فيها. ومع ذلك ، فإن استهداف الدقة العالية بشكل مفرط من قبل عدد كبير جدا من الأسطح يأتي على حساب تحميل حسابي مرتفع ، مما يتسبب في بطء معالجة الملفات.

للطباعة ثلاثية الأبعاد ، أثناء الطباعة ، يتم تشكيل الكائن المادي ثلاثي الأبعاد باستخدام مسح galvo السريع في المستوى x-y وحركة بيزو في الاتجاه z. هذا يركز شعاع ليزر الفيمتو ثانية داخل أي فوكسل 3D معين. ومع ذلك ، عندما تكون هياكل الطباعة أكبر من نطاقات التغطية المكانية ل galvo و piezo ، يجب تقسيم الكائن برمجيا إلى كتل. في حين أن هذا مطلب للأجزاء المطبوعة بحجم المليمتر ، فإن التقاطعات بين الكتل مرتبطة بخطوط خياطة (غير كاملة). يعد التحسين الدقيق لعدد الكتل ووضع خطوط الخياطة في اتجاهات x و y و z أمرا بالغ الأهمية لتجنب تعطيل الميزات الهندسية الحرجة للكائن النهائي بخطوط خياطة. قد تتشكل الفقاعات في واجهة الطباعة لأسباب مختلفة (على سبيل المثال ، شوائب الركائز المقاومة للضوء وعدم التجانس) ، وتؤثر سلبا على جودة وسلامة الهيكل المطبوع. علاوة على ذلك ، يمكن أن تؤدي طاقة الليزر العالية إلى زيادة حدوثها. سيؤدي تقليل طاقة الليزر ، عند أدنى طبقة من الجزء المطبوع ، إلى تقليل فرص تكوين الفقاعة. كبديل لطباعة الجزء بأكمله كهيكل صلب ، يمكن النظر في طريقة الصدفة والسقالة. يتضمن طباعة السطح الخارجي للجزء (الغلاف) فقط بالإضافة إلى عناصر المنشور الثلاثي بداخله. يتم فصل هذه العناصر بواسطة طبقات أفقية (سقالة) ، تحمل الراتنج غير المبلمر في جيوب صغيرة. تعمل هذه الطريقة على تقصير وقت الطباعة بشكل كبير ، وهو مناسب بشكل خاص للهياكل بحجم المليمتر. ومع ذلك ، نظرا لبقاء راتنج غير مبلمر ، فإن التعرض للأشعة فوق البنفسجية بعد الطباعة أمر ضروري لضمان الاستقرار الميكانيكي الكامل ، على الرغم من أنه يجب تنفيذ هذه الخطوة برفق لتجنب أي تشوه في الجزء المطبوع. يعتمد وقت ما بعد المعالجة على الراتنج المختار وسمك الجزء وطاقة الأشعة فوق البنفسجية40. للحصول على أفضل النتائج ، يوصى بإجراء تجربة أولية لتقدير الوقت اللازم للمعالجة الكاملة العمق ، باستخدام قطرة من مقاومة الضوء وتقييم قطعها المقطعي ، بعد التعرض للأشعة فوق البنفسجية. تتراوح فترة المعالجة المعتادة بين 5 إلى 20 دقيقة.

بالنسبة لقولبة النسخ المتماثلة PDMS ، قد يكون التصنيع النظيف لجهاز PDMS بميزات مقياس ميكرومتر ، مع عدم وجود مرافق غرفة نظيفة ، أمرا صعبا: يمكن أن تتواجد الجسيمات الدقيقة المحمولة بالهواء على السطح شديد الالتصاق لنظام PDMS وتعيق الختم بين الجهاز والركيزة ، أو تسد قسم القنوات الدقيقة الفردية. إن تنفيذ خطوات البروتوكول تحت غطاء التدفق الصفحي وحماية سطح PDMS باستمرار باستخدام الأيزوبروبانول يقلل بشكل كبير من مخاطر التلوث. تؤثر درجة حرارة المعالجة ومدتها بشكل مباشر على الربط المتقاطع PDMS والخصائص الفيزيائية الناتجة. على وجه الخصوص ، يعد التصاق PDMS المعالج عاملا حاسما. من ناحية ، يلزم وجود ختم محكم بين جهاز PDMS ، والسطح المستخدم لزراعة الخلايا العصبية (على سبيل المثال ، غطاء زجاجي أو MEA) ، لتقييد مرور الخلايا العصبية بشكل فعال. من ناحية أخرى ، يجب أن يتم توصيل جهاز PDMS بالسطح بشكل عكسي ، بحيث لا تتلف الطبقة العازلة الحساسة MEAs بعد إزالة الجهاز. بينما يحدث انكماش PDMS أثناء المعالجة ويمكن تصحيحه عن طريق إعادة قياس القالب مقدما ، بالنسبة لدرجات الحرارة وفترات المعالجة المشار إليها هنا ، سيكون الانكماش أقل من 2٪ 42 ولن يؤثر بشكل كبير على أجهزة PDMS أحادية الطبقة. بشكل عام ، اتبع بدقة قيم درجة حرارة المعالجة ومدتها الموصى بها ، للحصول على أفضل النتائج.

نظرة عامة على مزايا وقيود الطريقة
تم اقتراح تقنية تعتمد على الكتابة بالليزر المباشر 2 فوتون للتصنيع السريع للأجهزة البوليمرية الصغيرة الحجم للدراسة التجريبية للشبكات العصبية المعيارية. على عكس الطباعة الحجرية الضوئية اللينة ، لا يتطلب النهج المقترح مستوى عال من الخبرة الفنية ، بشرط أن يكون إعداد الطباعة الوظيفية 2PP 3D متاحا وعمليا. ومن اللافت للنظر أن هذه الطريقة تمكن من الانتقال من نموذج 3D المصمم من قبل CAD إلى جهاز PDMS وظيفي في غضون يوم واحد ، وبالتالي توفير مسار مباشر وفعال من المفهوم إلى الإدراك الملموس. على وجه التحديد ، فإن اختيار وضع الطباعة بالصدفة والسقالة يقلل بشكل كبير من الوقت اللازم لإنشاء القالب ، حيث تتم طباعة جزء صغير فقط من حجمه. تضمن المعالجة اللاحقة بالأشعة فوق البنفسجية للمكون المطبوع استقراره الميكانيكي ومتانته ، كما تم التحقق منه هنا على مدار 50 دورة صب باستخدام PDMS.

بالمقارنة مع الطرق التقليدية ، تتميز الطباعة 2PP 3D بميزة واضحة ، والتي تكون أكثر وضوحا عندما يتعلق الأمر بتصنيع القوالب ذات نسبة العرض إلى الارتفاع الكبيرة ، ومتطلبات الدقة الصعبة ، والهندسة ثلاثية الأبعاد المعقدة. إن إنتاج القوالب الرئيسية باستخدام الطباعة الحجرية القياسية للأشعة فوق البنفسجية مقيد بسمك مقاوم يبلغ حوالي 200 ميكرومتر. مطلوب تسلسلات معقدة من دورات الطلاء المغزلي والتعرض35 ، أو LIGA المكلفة (الطباعة الحجرية ، والطلاء الكهربائي ، والقولبة) ، أو عمليات النقش الأيوني التفاعلي العميق (DRIE)36 لتحقيق نسب ارتفاع وعرض إلى ارتفاع أكبر. في تناقض حاد ، كما هو موضح في العمل الرائد ل Kumi et al. في 201037 ، توفر تقنية 2PP نطاقا غير محدود بشكل أساسي لنسبة العرض إلى الارتفاع للأجزاء المطبوعة ، والتي تمتد من دون ميكرومتر إلى ملليمتر. هنا ، تم توضيح عملية التصنيع الدقيق للقالب مع اختلاف كبير في ارتفاع أجزائه ، والتي تتميز بتمييز يزيد عن 100 ضعف بين ارتفاع القنوات الدقيقة (5 ميكرومتر والحد الأقصى لارتفاع القالب (545 ميكرومتر ؛ انظر الشكل 2).

أيضا ، يمكن تحقيق استبانة الميكرومتر الفرعي بسهولة باتباع مواصفات البروتوكول الموضحة. وبالمقارنة ، فإن تحقيق دقة محسنة للقالب من خلال الطباعة الحجرية الضوئية للأشعة فوق البنفسجية يتطلب استثمار رأس المال. يتم تسعير الأقنعة ذات الدقة الأفضل ، باستخدام ترسب الكروم على الكوارتز بدقة اسمية تبلغ 600 نانومتر ، بعدة أوامر من حيث الحجم أعلى من أقنعة الشفافية العلوية المطبوعة بالليزر ، والتي تمتلك دقة 250 ميكرومتر35 ، ومع ذلك انظر عمل Pirlo et al.41. لكي تكون قابلة للتطبيق للاستخدام الداخلي ، يجب أن تكون الطريقة المختارة فعالة من حيث التكلفة. بالنسبة للعديد من المختبرات البيولوجية ، فإن التكلفة الإجمالية المرتبطة بالطباعة الحجرية الضوئية اللينة التقليدية أو الكتابة بالليزر المباشر تمثل حاجزا. في حين أنه من الممكن جعل كلتا التقنيتين أكثر سهولة من خلال شراء وتجميع المكونات الأساسية ، فإن هذا النهج يتطلب خبرة إضافية ولا يزال يتطلب استثمارا ملحوظا. في هذا السياق ، هناك نقطة أساسية يجب مراعاتها وهي الطيف الأوسع للتطبيقات التي يمكن تحقيقها من خلال الكتابة بالليزر المباشر. على عكس الطباعة الحجرية الضوئية اللينة التقليدية ، التي تقتصر في المقام الأول على التصنيع الدقيق للقوالب ، فإن الطباعة 2PP 3D تعرض تنوعا ملحوظا. تمتد تطبيقاته المحتملة من الموائع الدقيقة والبصريات الدقيقة إلى الضوئيات المتكاملة والميكانيكا الدقيقة. وهذا يجعل الاستثمار في هذه التكنولوجيا جذابا كمرفق مشترك لمجالات علمية متعددة ومتنوعة. على سبيل المثال ، المنهجية القائمة على 2PP المصممة في هذا البروتوكول هي نتيجة تعاون متعدد التخصصات بين أقسام علم الأعصاب والرياضيات داخل مؤسستنا. بالإضافة إلى ذلك ، يعد تطوير مقاومة الضوء مجالا نشطا للبحث ، ويمكن أن يوسع نطاق تطبيقات الطباعة 2PP 3D. ومن الأمثلة على ذلك إدخال راتنج IP-PDMS مؤخرا. من خلال البلمرة في هياكل ذات خصائص مثل PDMS38 ، يفتح هذا الراتنج إمكانية التصنيع الدقيق المباشر للمكونات المتوافقة حيويا التي لها سطح معقد أو تحتوي على مساحات مجوفة. تقف هذه التعقيدات كحواجز أمام تحقيق نتائج مماثلة من خلال إجراءات صب النسخ المتماثلة التقليدية.

كدليل على هذه الطريقة ، تم تقديم أدلة تشير إلى تطوير اتصال أحادي الاتجاه بين وحدتين في شبكة عصبية معيارية. كان للقالب الصغير ، الذي تم تصنيعه بواسطة تقنية 2PP ، قدرة تحمل كافية للخضوع لصب PDMS متعدد ، ولديه الدقة المطلوبة على نطاق صغير. وفي الختام، فإن نطاق تطبيق البروتوكول الموصوف في هذا العمل يتجاوز الحالة الموضحة. مع انتشار الوصول إلى تقنية الطباعة 2PP بشكل متزايد ، سينخفض الاستثمار الأولي المطلوب لتنفيذها بينما سيتوسع نطاق تطبيقاتها المحتملة.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

يقر M.G. بالدعم المالي من برنامج إطار عمل H2020 التابع للاتحاد الأوروبي من خلال مجلس الابتكار الأوروبي (مشروع IN-FET ، GA n. 862882 ، مشروع Arbor-IO ، FLAG-ERA ومشروع الدماغ البشري ، ID 650003) ومن SISSA (منطقة علم الأعصاب). تعترف G.N. بالدعم المالي من وزارة الجامعات والبحوث الإيطالية (MUR) من خلال منحة Dipartimenti di Eccellenza 2018-2022 (مجال الرياضيات). نشكر M. Gigante و B. Pastore و M. Grandolfo على مساعدتهم في الطباعة ثلاثية الأبعاد 3D ، وزراعة الخلايا ، والتصوير الحي ، وكذلك Drs. P. Massobrio و P. Heppenstall و L. Ballerini و Di Clemente و HC Schultheiss على المناقشات. لم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات وتحليلها أو قرار النشر أو إعداد المخطوطة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Propanol Sigma-Aldrich 650447
BB cure compact polymerizer PCube Srl Wavelengths 365-405 nm, Power 120W
BioMed Amber Resin 1 L formlabs Resin used for mounting the 3D Printed mold to Petri dish
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A9418
CAD application software SolidWorks Dassault Systèmes SolidWorks Corporation, US Fusion 360 (Autodesk Inc., US), AutoCAD (Autodesk Inc., US), PTC Creo (PTC corp., US), SolidWorks (Dassault Systèmes SolidWorks corp., US) and Tinkercad (Autodesk Inc., US).
                                 --------------------------------------
Tutorials: https://www.mycadsite.com/tutorials.html
Trainings: https://www.autodesk.com/training
CellTracker Green CMFDA Invitrogen C7025
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270
D-AP5 Tocris #0106
Deoxyribonuclease I Sigma-Aldrich D5025
DeScribe Nanoscribe GmbH & Co. KG
di-Sodium hydrogen phosphate Sigma-Aldrich 106585
Gentamicin Thermo Fisher 15710049
Hanks′ Balanced Salts Sigma-Aldrich H2387
HEPES Sigma-Aldrich H7523
Horse Serum Sigma-Aldrich H1138
in vitro MEA recording system MEA2000 mini Multichannel Systems GmBH, Reutlingen, Germany
IP-S Photoresist Nanoscribe GmbH & Co. KG
Kynurenic acid Sigma-Aldrich K3375
L-Glutamine (200 mM) Gibco 25030081
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M2643
MEA recording application software (Experimenter) Multichannel Systems GmBH, Reutlingen, Germany
Minimum Essential Medium Sigma-Aldrich 51412C
NanoWrite Nanoscribe GmbH & Co. KG
ophthalmic stab Knife 15° HESTIA Medical
Photonic Professional GT2 (PPGT2) 3D printer Nanoscribe GmbH & Co. KG SN617
Plasma Cleaner HARRICK PLASMA
Poly(ethyleneimine) solution Sigma-Aldrich P3143
Potassium chloride Sigma-Aldrich P3911
Propylene glycol methyl ether acetate (PGMEA) Sigma-Aldrich 484431
Repel-silane ES Sigma-Aldrich GE17133201
Soda lime ITO-coated substrates for 3D MF DiLL Nanoscribe GmbH & Co. KG
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S6014
Sodium chloride Sigma-Aldrich S9888
Substrate-integrated planar MEAs (120MEA100/30iR-ITO-gr) Multichannel Systems GmBH, Reutlingen, Germany TiN electrodes, SiN isolator, 4 internal reference electrodes,120 recording electrodes, Electrode spacing 100 µm,Electrode diameter 30 µm
SYLGARD 184 Kit Dow Corning
Trypsin Sigma-Aldrich T1005
Trypsin inhibitor Sigma-Aldrich T9003
vacuum pump Single phase asynchronous 2 poles  CIMAMOTORI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kanagasabapathi, T. T., et al. Dual-compartment neurofluidic system for electrophysiological measurements in physically segregated and functionally connected neuronal cell culture. Front Neuroeng. 4, 13 (2011).
  2. Maeda, E., Robinson, H. P. C., Kawana, A. The mechanisms of generation and propagation of synchronized bursting in developing networks of cortical neurons. J Neurosci. 15 (10), 6834-6845 (1995).
  3. Wheeler, B. C., Brewer, G. J. Designing neural networks in culture. Proc IEEE Inst Electr Electron Eng. 98 (3), 398-406 (2010).
  4. DeMarse, T. B., Pan, L., Alagapan, S., Brewer, G. J., Wheeler, B. C. Feed-forward propagation of temporal and rate information between cortical populations during coherent activation in engineered in vitro networks. Front Neural Circuits. 10, 32 (2016).
  5. Kanagasabapathi, T. T., et al. Functional connectivity and dynamics of cortical-thalamic networks co-cultured in a dual compartment device. J Neural Eng. 9 (3), 036010 (2012).
  6. Brofiga, M., Pisano, M., Tedesco, M., Raiteri, R., Massobrio, P. Three-dimensionality shapes the dynamics of cortical interconnected to hippocampal networks. J Neural Eng. 15 (5), 056044 (2020).
  7. Bisio, M., Bosca, A., Pasquale, V., Berdondini, L., Chiappalone, M. Emergence of bursting activity in connected neuronal sub-populations. PLoS One. 9 (9), e107400 (2014).
  8. Hasan, M. F., Berdichevsky, Y. Neural circuits on a chip. Micromachines. 7 (9), 157 (2016).
  9. Aebersold, M. J., et al. 34;Brains on a chip": Towards engineered neural networks. TrAC Tren Anal Chem. 78, 60-69 (2016).
  10. Zamora-López, G., Chen, Y., Deco, G., Kringelbach, M. L., Zhou, C. Functional complexity emerging from anatomical constraints in the brain: The significance of network modularity and rich-clubs. Sci Rep. 6, 38424 (2016).
  11. Eytan, D., Marom, S. Dynamics and effective topology underlying synchronization in networks of cortical neurons. J Neurosci. 26 (33), 8465-8476 (2006).
  12. Pan, L., Alagapan, S., Franca, E., Brewer, G. J., Wheeler, B. C. Propagation of action potential activity in a predefined microtunnel neural network. J Neural Eng. 8 (4), 046031 (2011).
  13. Virlogeux, A., et al. Reconstituting corticostriatal network on-a-chip reveals the contribution of the presynaptic compartment to Huntington's disease. Cell Rep. 22 (1), 110-122 (2018).
  14. Kleinfeld, D., Kahler, K., Hockberger, P. E. Controlled outgrowth of dissociated neurons on patterned substrates. J Neurosci. 8 (11), 4098-4120 (1988).
  15. Vogt, A. K., Wrobel, G., Meyer, W., Knoll, W., Offenhäusser, A. Synaptic plasticity in micropatterned neuronal networks. Biomaterials. 26 (15), 2549-2557 (2005).
  16. Staii, C., et al. Positioning and guidance of neurons on gold surfaces by directed assembly of proteins using atomic force microscopy. Biomaterials. 30 (20), 3397-3404 (2009).
  17. Fricke, R., et al. Axon guidance of rat cortical neurons by microcontact printed gradients. Biomaterials. 32 (8), 2070-2076 (2011).
  18. Gladkov, A., et al. Design of cultured neuron networks in vitro with predefined connectivity using asymmetric microfluidic channels. Sci Rep. 7 (1), 15625 (2017).
  19. le Feber, J., Postma, W., de Weerd, E., Weusthof, M., Rutten, W. L. Barbed channels enhance unidirectional connectivity between neuronal networks cultured on multi electrode arrays. Front Neurosci. 9, 412 (2015).
  20. Peyrin, J. M., et al. Axon diodes for the reconstruction of oriented neuronal networks in microfluidic chambers. Lab Chip. 11 (21), 3663-3673 (2011).
  21. Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography. Angewandte Chemie - International Edition. 37 (5), 550-575 (1998).
  22. Qi, D., Hoelzle, D. J., Rowat, A. C. Probing single cells using flow in microfluidic devices. Eur Phys J Spec Top. 204, 85-101 (2012).
  23. Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. Multi-step variable height photolithography for valved multilayer microfluidic devices. J Vis Exp. (119), e55276 (2017).
  24. Levis, M., Ontiveros, F., Juan, J., Kavanagh, A., Zartman, J. J. Rapid fabrication of custom microfluidic devices for research and educational applications. J Vis Exp. (153), e60307 (2019).
  25. Maruo, S., Nakamura, O., Kawata, S. Three-dimensional microfabrication with two-photon-absorbed photopolymerization. Opt Lett. 22 (2), 132-134 (1997).
  26. Baldacchini, T. Three-dimensional microfabrication using two-photon polymerization: Fundamentals, technology, and applications. , Elsevier. (2015).
  27. Madou, M. J. Fundamentals of Microfabrication. , CRC Press. (2018).
  28. Sun, H. B., Kawata, S. Two-photon photopolymerization and 3D lithographic microfabrication. NMR, 3D Anal, Photopolymeriz. Adv Poly Sci. 170, 169-273 (2004).
  29. Marom, S., Shahaf, G. Development, learning and memory in large random networks of cortical neurons: Lessons beyond anatomy. Q Rev Biophys. 35 (1), 63-87 (2002).
  30. Kamioka, H., Maeda, E., Jimbo, Y., Robinson, H. P. C., Kawana, A. Spontaneous periodic synchronized bursting during formation of mature patterns of connections in cortical cultures. Neurosci Lett. 206 (2-3), 109-112 (1996).
  31. Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. How to culture, record and stimulate neuronal networks on micro-electrode arrays (MEAs). J Vis Exp. (39), e2056 (2010).
  32. Mahmud, M., Pulizzi, R., Vasilaki, E., Giugliano, M. QSPIKE tools: A generic framework for parallel batch preprocessing of extracellular neuronal signals recorded by substrate microelectrode arrays. Front Neuroinform. 8, 26 (2014).
  33. Pulizzi, R., et al. Brief wide-field photostimuli evoke and modulate oscillatory reverberating activity in cortical networks. Sci Rep. 6 (1), 24701 (2016).
  34. Scarsi, F., Tessadori, J., Chiappalone, M., Pasquale, V. Investigating the impact of electrical stimulation temporal distribution on cortical network responses. BMC Neurosci. 18 (1), 49 (2017).
  35. Friend, J., Yeo, L. Fabrication of microfluidic devices using polydimethylsiloxane. Biomicrofluidics. 4 (2), 026502 (2010).
  36. Kim, K., et al. Rapid replication of polymeric and metallic high aspect ratio microstructures using PDMS and liga technology. Microsystem Technologies. 9 (1-2), 5-10 (2002).
  37. Kumi, G., Yanez, C. O., Belfield, K. D., Fourkas, J. T. High-speed multiphoton absorption polymerization: Fabrication of microfluidic channels with arbitrary cross-sections and high aspect ratios. Lab Chip. 10 (8), 1057-1060 (2010).
  38. Bunea, A. I., et al. et al.Micro 3D printing by two-photon polymerization: Configurations and parameters for the nanoscribe system. Micro. 1 (2), 164-180 (2021).
  39. Taylor, A., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat Methods. 2 (8), 599-605 (2005).
  40. Oakdale, J. S., Ye, J., Smith, W. L., Biener, J. Post-print UV curing method for improving the mechanical properties of prototypes derived from two-photon lithography. Opt. Express. 24 (24), 27077-27086 (2016).
  41. Pirlo, R. K., Sweeney, A. J., Ringeisen, B. R., Kindy, M., Gao, B. Z. Biochip/laser cell deposition system to assess polarized axonal growth from single neurons and neuron/glia pairs in microchannels with novel asymmetrical geometries. Biomicrofluidics. 5 (1), 13408 (2011).
  42. Madsen, M. H., Feidenhans'l, N. A., Hansen, P. E., Garnæs, J., Dirscherl, K. Accounting for PDMS shrinkage when replicating structures. J Micromech Microeng. 24 (12), 127002 (2014).
  43. Comina, G., Suskaa, A., Filippini, D. PDMS lab-on-a-chip fabrication using 3D printed templates. Lab Chip. 14 (2), 424-430 (2013).
  44. Chan, H. N., et al. one-step molding of 3D-printed structures for convenient fabrication of truly 3D PDMS microfluidic chips. Microfluid Nanofluid. 19, 9-18 (2015).

Tags

علم الأعصاب ، العدد 208 ،
ثنائي الفوتون البلمرة 3D الطباعة من أجهزة زراعة الخلايا العصبية على نطاق صغير
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hosseini, A., Noselli, G.,… More

Hosseini, A., Noselli, G., Giugliano, M. Two-Photon Polymerization 3D-Printing of Micro-scale Neuronal Cell Culture Devices. J. Vis. Exp. (208), e66142, doi:10.3791/66142 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter