פונקציה ג'ין יכול להיות מוסתר על הפסד של פונקציה ניסויים אם קיים פיצוי על ידי גן אחר. המודל של דג הזברה מספק תפוקה גבוהה יחסית אמצעי לחשוף יתירות פונקציונלית כאלה עוברים חיים.
פונקציה ג'ין במהלך embryogenesis מוגדר בדרך כלל על ידי אובדן של פונקציה ניסויים, למשל על ידי mutagenesis ממוקד (נוקאאוט) בתוך העכבר. במודל דג הזברה, יעיל טכניקות גנטיות הפוך פותחו באמצעות microinjection של גן ספציפי morpholinos antisense. Morpholinos יעד mRNA באמצעות זיווג בסיסים ספציפיים גן פונקציה לחסום זמנית על ידי תרגום שחבור עיכוב או במשך מספר ימים במהלך embryogenesis (מציאה). עם זאת, בעלי חוליות כמו עכבר או דג הזברה, פונקציות כמה גנים יכולים להיות מוסתר על ידי גישות אלו בשל נוכחותם של גן אחר אשר מפצה על אובדן. זה נכון במיוחד עבור משפחות גנים המכילים גנים אחותו כי הם שיתוף לידי ביטוי בפיתוח רקמות זהה. בשנת דג הזברה, פיצוי תפקודית ניתן לבדוק באופן יחסית תפוקה גבוהה, על ידי הזרקה משותף של morpholinos כי היעד מציאה של שני גנים בעת ובעונה אחת. כמו כן, באמצעות morpholinos, אינטראקציה גנטית בין כל שני גנים ניתן להדגים על ידי מציאה של גנים שניהם יחד משנה סף רמות. לדוגמה, ניתן morpholinos טיטרציה כזו לא מציאה הפרט יוצר פנוטיפ. אם, בתנאים אלה, שיתוף הזרקה של שני morpholinos גורם פנוטיפ, אינטראקציה גנטית מוצג. כאן אנו מדגימים כיצד להראות יתירות פונקציונלית בהקשר של שני גורמי תעתוק הקשורות גאטה. גורמים gata חיוניים מפרט של אבות לב, אבל זה מתגלה רק על ידי אובדן של שני Gata5 ו Gata6. אנו מראים כיצד לבצע ניסויים microinjection, לאמת את morpholinos, ולהעריך את הפנוטיפ פיצוי cardiogenesis.
בניסוי המתואר כאן, אנחנו בשילוב שני morpholinos, שכל אחד מהם לבדו ליצור מגוון של פנוטיפים שונים, ומצא פנוטיפ שונה לגמרי כשהיו שיתוף מוזרק ביחד. כמובן, אנחנו צריכים להצדיק את ביצוע הניסוי הזה מלכתחילה. חשדנו כי שני גנים יכול לפצות אחד את השני עבור פונקציה קודמת, במפרט במקרה ז…
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים לחברי מעבדה אוונס על עזרתם בהכנת המצגת. Morpholinos השתמשו כאן היו תקפות במקור על ידי ד"ר אודרי Holtzinger. TE נתמך על ידי מענקים מהמוסד הלאומי לבריאות (HL064282 ו HL056182). ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי המכון לטיפול בבעלי חיים ועדת שימוש, של וייל קורנל מדיקל קולג'.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Fish breeder tanks and dividers | Aquatic Habitats | |||
Fish nets | Aquatic Habitats | |||
System water | 60mg “Instant Ocean” per liter dH2O | |||
100mm Petri dishes | BD Falcon | 351029 | ||
Micropipette needle puller | Sutter instruments, Co. | P-97 Flaming/Brown | ||
3.5″ glass capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | ||
Razor blade | Personna | 94-120-71 | ||
Micro grinder | Narishige, Japan | EG-4 | ||
Gridded microscope eyepiece | Premiere | MF-02 | ||
Micrometer | Ward’s Natural Science | 94 W 9910 | ||
Ultrapure agarose | Invitrogen | 15510-027 | ||
Spatula | Fisher | 14-357Q | ||
Scale | Mettler Toledo | AB54-S/FACT | ||
Disposable weigh dishes | Fisher | 2-202-B | ||
Conventional microwave | General Electric | |||
Erlenmeyer flask | Corning | 4980 | ||
Microscope slides | Fisher | 12-552 | ||
Graduated cylinder | Fisher | 08-572-6D | ||
Automatic pipette man | BrandTech | 2026333 | ||
70% ethanol wash solution | Tarr | 801VWR | ||
N2 tank | Tech Air | |||
Microinjector | Harvard apparatus | PLI-100 | ||
Micromanipulator | Micro Instruments | LTD | ||
Dissecting microscope | Nikon | SMZ1500 | ||
Parafilm | American National Can | PM-992 | ||
Mineral oil | Sigma | M5904 | ||
Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | ||
gata5 splice site morpholino | Genetools, LLC | 5′-TCTTAAGATTTTTACCTATACTGGA-3′ | ||
gata5 ATG Blocker | Genetools, LLC | 5′-AAGATAAAGCCAGGCTCGAATACAT-3′ | ||
gata6 Long Isoform ATG Blocker | Genetools, LLC | 5′-AGCTGTTATCACCCAGGTCCATCCA-3′ | ||
Disposable Pasteur Pipette | Fisher Scientific | 13-678-20B | ||
Tricaine Methanesulfonate | Argent Chemical Laboratories | MS-222 | ||
Methycellulose | ICN Biomedicals | 155495 | ||
Heat Block | Fisher | 11-718-4 | ||
Sharp forceps | Dumont | Size 55 | ||
Depression Microslides | VWR | 48339-009 |