Een omgekeerde genetische benadering van functionele redundantie Test tijdens de embryogenese
Summary
Gen functie kan worden verduisterd in de verlies-van-functie experimenten als er sprake is compensatie door een ander gen. De zebravis model biedt een relatief high-throughput middel om dergelijke functionele redundantie onthullen in levende embryo's.
Abstract
Gene functie tijdens de embryogenese wordt meestal bepaald door het verlies-van-functie experimenten, bijvoorbeeld door middel van gerichte mutagenese (knock-out) in de muis. In de zebravis model, doeltreffende omgekeerde genetische technieken die zijn ontwikkeld met behulp van micro-injectie van gen-specifieke antisense morpholinos. Morpholinos doel een mRNA via specifieke base-pairing en blokkeren genfunctie tijdelijk door het remmen van vertaling of splitsen voor meerdere dagen tijdens de embryogenese (knockdown). Echter, in gewervelde dieren zoals muizen of zebravissen, kunnen sommige genfuncties worden gestoord door deze benaderingen door de aanwezigheid van een ander gen, dat compenseert het verlies. Dit geldt vooral voor gen-families met zus genen die co-uitgedrukt in dezelfde ontwikkelen van weefsels. In de zebravis, kan functionele compensatie worden getest in een relatief high-throughput wijze, door co-injectie van morpholinos die zich richten op knockdown van beide genen tegelijk. Ook met behulp van morpholinos, kan een genetische interactie tussen twee genen worden aangetoond door knockdown van beide genen samen op sub-threshold levels. Kan bijvoorbeeld morpholinos worden getitreerd zodanig dat noch individuele knockdown een fenotype genereert. Als onder deze omstandigheden, co-injectie van beide morpholinos veroorzaakt een fenotype, is een genetische interactie getoond. Hier laten we zien hoe de functionele redundantie show in het kader van twee verwante GATA transcriptiefactoren. GATA factoren zijn essentieel voor de specificatie van cardiale voorlopercellen, maar dit is alleen onthuld door het verlies van zowel Gata5 en Gata6. We laten zien hoe het uitvoeren van micro-injectie experimenten, valideren morpholinos, en evalueren van het gecompenseerde fenotype voor cardiogenese.
Protocol
Discussion
In het experiment hier beschreven, combineerden we twee morpholinos, die elk alleen al het genereren van een duidelijke reeks van fenotypen, en vond een heel ander fenotype toen ze samen waren co-injectie. Uiteraard moesten we een rechtvaardiging voor het doen van dit experiment in de eerste plaats. We vermoedden dat de twee genen kunnen elkaar compenseren voor een eerdere functie, in dit geval hart-specificatie. Dit komt omdat de genen zijn zeer verwant (en in staat te binden aan dezelfde DNA-sequenties) en worden uitg…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken de leden van de Evans laboratorium voor hun hulp bij de voorbereiding van deze presentatie. De morpholinos hier gebruikt werden oorspronkelijk gevalideerd door dr. Audrey Holtzinger. TE wordt ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (HL064282 en HL056182). Experimenten op dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften uiteengezet door het Institute for Animal Care en gebruik Comite dat is ingesteld, van het Weill Cornell Medical College.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Fish breeder tanks and dividers | Aquatic Habitats | |||
| Fish nets | Aquatic Habitats | |||
| System water | 60mg “Instant Ocean” per liter dH2O | |||
| 100mm Petri dishes | BD Falcon | 351029 | ||
| Micropipette needle puller | Sutter instruments, Co. | P-97 Flaming/Brown | ||
| 3.5″ glass capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | ||
| Razor blade | Personna | 94-120-71 | ||
| Micro grinder | Narishige, Japan | EG-4 | ||
| Gridded microscope eyepiece | Premiere | MF-02 | ||
| Micrometer | Ward’s Natural Science | 94 W 9910 | ||
| Ultrapure agarose | Invitrogen | 15510-027 | ||
| Spatula | Fisher | 14-357Q | ||
| Scale | Mettler Toledo | AB54-S/FACT | ||
| Disposable weigh dishes | Fisher | 2-202-B | ||
| Conventional microwave | General Electric | |||
| Erlenmeyer flask | Corning | 4980 | ||
| Microscope slides | Fisher | 12-552 | ||
| Graduated cylinder | Fisher | 08-572-6D | ||
| Automatic pipette man | BrandTech | 2026333 | ||
| 70% ethanol wash solution | Tarr | 801VWR | ||
| N2 tank | Tech Air | |||
| Microinjector | Harvard apparatus | PLI-100 | ||
| Micromanipulator | Micro Instruments | LTD | ||
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ1500 | ||
| Parafilm | American National Can | PM-992 | ||
| Mineral oil | Sigma | M5904 | ||
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | ||
| gata5 splice site morpholino | Genetools, LLC | 5′-TCTTAAGATTTTTACCTATACTGGA-3′ | ||
| gata5 ATG Blocker | Genetools, LLC | 5′-AAGATAAAGCCAGGCTCGAATACAT-3′ | ||
| gata6 Long Isoform ATG Blocker | Genetools, LLC | 5′-AGCTGTTATCACCCAGGTCCATCCA-3′ | ||
| Disposable Pasteur Pipette | Fisher Scientific | 13-678-20B | ||
| Tricaine Methanesulfonate | Argent Chemical Laboratories | MS-222 | ||
| Methycellulose | ICN Biomedicals | 155495 | ||
| Heat Block | Fisher | 11-718-4 | ||
| Sharp forceps | Dumont | Size 55 | ||
| Depression Microslides | VWR | 48339-009 |
Referências
- Heicklen-Klein, A., McReynolds, L. J., Evans, T. Using the zebrafish model to study GATA transcription factors. Semin Cell Dev Biol. 16, 95-106 (2005).
- Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6, 69-77 (2009).
- Holtzinger, A., Evans, T. Gata5 and Gata6 are functionally redundant in zebrafish for specification of cardiomyocytes. Dev Biol. 312, 613-622 (2007).
- Peterkin, T., Gibson, A., Patient, R. Redundancy and evolution of GATA factor requirements in development of the myocardium. Dev Biol. 311, 623-635 (2007).
- Holtzinger, A., Evans, T. Gata4 regulates the formation of multiple organs. Development. 132, 4005-4014 (2005).
- Sorrentino, R. P., Gajewski, K. M., Schulz, R. A. GATA factors in Drosophila heart and blood cell development. Semin Cell Dev Biol. 16, 107-116 (2005).
