Embryogenesis 동안 중복 기능을 테스트하기 위해 역방향 유전자 접근
Summary
다른 유전자에 의해 보상이있다면 유전자 기능이 손실의 기능 실험에 드러나지 수 있습니다. zebrafish 모델은 생활 배아에서 이러한 기능 중복을 나타내기 위해 상대적으로 높은 처리량 방법을 제공합니다.
Abstract
embryogenesis 동안 유전자 기능은 일반적으로 마우스를 대상으로 돌연변이 유발 (녹아웃)에 의해 예를 들어, 손실의 기능을 실험에 의해 정의됩니다. zebrafish 모델에서 효과적인 반대로 유전자 기술은 유전자 특정 안티 센스 morpholinos의 microinjection을 사용하여 개발되었습니다. Morpholinos은 embryogenesis (최저)에 며칠 동안 억제 번역 또는 splicing에 의해 transiently 특정 기본 – 페어링 및 차단 유전자 기능을 통해 mRNA를 타겟팅할 수 있습니다. 그러나, 마우스 또는 zebrafish과 같은 척추 동물에서 일부 유전자의 기능이 손실에 대한 보상 다른 유전자의 존재로 인해 이러한 방식으로 드러나지 수 있습니다. 이 같은 개발 조직의 공동 표현 자매 유전자를 포함한 유전자 가족에 특히 사실이다. zebrafish에서 기능성 보상은 morpholinos의 공동 주입하여 상대적으로 높은 처리량 방식으로 테스트할 수있는 동시에 유전자의 대상 최저. 마찬가지로, morpholinos를 사용하여 임의의 두 유전자 사이에 유전자 상호 작용이 하위 임계값 수준에서 함께 두 유전자의 분해에 의해 입증하실 수 있습니다. 예를 들어, morpholinos는 어느 개인의 분해가 표현형을 생성 이러한 titrated 수 있습니다. 이러한 조건에서 두 morpholinos의 공동 주사가 표현형 원인 경우, 유전자 상호 작용이 나타납니다. 여기 두 관련 가타의 전사 요소의 컨텍스트에서 기능 중복을 표시하는 방법을 보여줍니다. 가타 요인은 심장 progenitors의 사양에 필수적인,하지만 이것은 Gata5와 Gata6 모두의 손실에 의해 드러났습니다. 우리는 microinjection 실험을 수행 morpholinos를 확인하고, cardiogenesis에 대한 보상 표현형을 평가하는 방법을 보여줍니다.
Protocol
Discussion
실험이 여기에 설명된에서는, 우리는 두 morpholinos 혼자 phenotypes의 독특한 범위를 생성하는 각각을 결합하고, 그들이 함께 공동으로 주입되었다 완전히 다른 표현형을 발견했습니다. 물론, 우리는 처음부터이 실험을 수행하는 명분이 필요했습니다. 우리는 두 유전자이 경우 심장 사양에, 이전 기능에 대한 서로를 보상 수도 의심. 유전자가 매우 관련이 있습니다 (같은 DNA 시퀀스에 바인딩 수)과 <sup…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 프레 젠 테이션을 준비하는 그들의 도움 에반스 실험실 구성원 감사합니다. 여기에 사용되는 morpholinos는 원래 박사 오드리 Holtzinger에 의해 확인되었다. TE는 국립 보건원 (HL064282 및 HL056182)에서 기금에 의해 지원됩니다. 동물 실험은 웨일 코넬 메디컬 칼리지의 동물 관리 및 사용위원회 연구소에 의해 명시된 지침 및 규정에 따라 수행되었다.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Fish breeder tanks and dividers | Aquatic Habitats | |||
| Fish nets | Aquatic Habitats | |||
| System water | 60mg “Instant Ocean” per liter dH2O | |||
| 100mm Petri dishes | BD Falcon | 351029 | ||
| Micropipette needle puller | Sutter instruments, Co. | P-97 Flaming/Brown | ||
| 3.5″ glass capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | ||
| Razor blade | Personna | 94-120-71 | ||
| Micro grinder | Narishige, Japan | EG-4 | ||
| Gridded microscope eyepiece | Premiere | MF-02 | ||
| Micrometer | Ward’s Natural Science | 94 W 9910 | ||
| Ultrapure agarose | Invitrogen | 15510-027 | ||
| Spatula | Fisher | 14-357Q | ||
| Scale | Mettler Toledo | AB54-S/FACT | ||
| Disposable weigh dishes | Fisher | 2-202-B | ||
| Conventional microwave | General Electric | |||
| Erlenmeyer flask | Corning | 4980 | ||
| Microscope slides | Fisher | 12-552 | ||
| Graduated cylinder | Fisher | 08-572-6D | ||
| Automatic pipette man | BrandTech | 2026333 | ||
| 70% ethanol wash solution | Tarr | 801VWR | ||
| N2 tank | Tech Air | |||
| Microinjector | Harvard apparatus | PLI-100 | ||
| Micromanipulator | Micro Instruments | LTD | ||
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ1500 | ||
| Parafilm | American National Can | PM-992 | ||
| Mineral oil | Sigma | M5904 | ||
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | ||
| gata5 splice site morpholino | Genetools, LLC | 5′-TCTTAAGATTTTTACCTATACTGGA-3′ | ||
| gata5 ATG Blocker | Genetools, LLC | 5′-AAGATAAAGCCAGGCTCGAATACAT-3′ | ||
| gata6 Long Isoform ATG Blocker | Genetools, LLC | 5′-AGCTGTTATCACCCAGGTCCATCCA-3′ | ||
| Disposable Pasteur Pipette | Fisher Scientific | 13-678-20B | ||
| Tricaine Methanesulfonate | Argent Chemical Laboratories | MS-222 | ||
| Methycellulose | ICN Biomedicals | 155495 | ||
| Heat Block | Fisher | 11-718-4 | ||
| Sharp forceps | Dumont | Size 55 | ||
| Depression Microslides | VWR | 48339-009 |
Referências
- Heicklen-Klein, A., McReynolds, L. J., Evans, T. Using the zebrafish model to study GATA transcription factors. Semin Cell Dev Biol. 16, 95-106 (2005).
- Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6, 69-77 (2009).
- Holtzinger, A., Evans, T. Gata5 and Gata6 are functionally redundant in zebrafish for specification of cardiomyocytes. Dev Biol. 312, 613-622 (2007).
- Peterkin, T., Gibson, A., Patient, R. Redundancy and evolution of GATA factor requirements in development of the myocardium. Dev Biol. 311, 623-635 (2007).
- Holtzinger, A., Evans, T. Gata4 regulates the formation of multiple organs. Development. 132, 4005-4014 (2005).
- Sorrentino, R. P., Gajewski, K. M., Schulz, R. A. GATA factors in Drosophila heart and blood cell development. Semin Cell Dev Biol. 16, 107-116 (2005).
