Un enfoque de genética inversa para probar la redundancia funcional durante la embriogénesis

Summary

Función de los genes puede ser oscurecida en los experimentos de la pérdida de función de si hay una compensación por otro gen. El modelo de pez cebra ofrece un relativamente alto rendimiento medio para revelar la redundancia funcional como en embriones vivos.

Abstract

Función de los genes durante la embriogénesis se define por los experimentos de pérdida de función, por ejemplo, mediante mutagénesis dirigida (knockout) en el ratón. En el modelo de pez cebra, técnicas efectivas de genética inversa se han desarrollado mediante la microinyección de morfolinos antisentido de genes específicos. Morfolinos objetivo a través de un ARNm específico de apareamiento de bases y la función del gen bloquear transitoriamente por la traducción de inhibir o empalme por varios días durante la embriogénesis (caída). Sin embargo, en los vertebrados, como el ratón o el pez cebra, algunas funciones de los genes puede ser oscurecida por estos métodos debido a la presencia de otro gen que compensa la pérdida. Esto es especialmente cierto para las familias de genes que contienen genes de la hermana que son co-expresados ​​en los mismos tejidos en desarrollo. En el pez cebra, la compensación funcional puede ser probado de una manera relativamente alto rendimiento, por co-inyección de morfolinos que se dirigen a la precipitación de los dos genes simultáneamente. Del mismo modo, con morfolinos, una interacción genética entre dos genes puede ser demostrado por la precipitación de ambos genes en conjunto en los niveles sub-umbral. Por ejemplo, morfolinos pueden ajustarse de manera que ni caída individual genera un fenotipo. Si, bajo estas condiciones, la co-inyección de ambos morfolinos causa un fenotipo, una interacción genética se muestra. Aquí se demuestra cómo mostrar redundancia funcional en el contexto de dos factores relacionados con la transcripción GATA. GATA factores son esenciales para la especificación de los progenitores cardíacos, pero esto sólo se revela por la pérdida de ambos GATA5 y Gata6. Se muestra cómo llevar a cabo experimentos de microinyección, validar los morfolinos, y evaluar el fenotipo compensado cardiogénesis.

Protocol

Nuestro objetivo es poner a prueba la redundancia funcional de dos factores de transcripción para la especificación de los progenitores de los cardiomiocitos. Los factores son codificados por dos genes relacionados con GATA5 y GATA6 y estamos utilizando el modelo de pez cebra para comprender sus funciones en relación 1. Nuestra estrategia es bloquear la función de genes usando morfolinos 2. Vamos a inyectar morfolinos para uno u otro gen en huevos fertilizados, y comparar el fenotipo e…

Discussion

En el experimento descrito aquí, combinamos dos morfolinos, cada uno de los cuales solo generan una gama de fenotipos distintos, y se encontró un fenotipo completamente diferente cuando se co-inyectados juntos. Por supuesto, necesitamos una justificación para hacer este experimento en el primer lugar. La sospecha de que los dos genes podría compensar entre sí por una función anterior, en este caso la especificación cardíaco. Esto se debe a los genes están muy relacionados (y capaces de unirse a secuencias de AD…

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Fish breeder tanks and dividers		Aquatic Habitats
Fish nets		Aquatic Habitats
System water				60mg “Instant Ocean” per liter dH2O
100mm Petri dishes		BD Falcon	351029
Micropipette needle puller		Sutter instruments, Co.	P-97 Flaming/Brown
3.5″ glass capillaries		Drummond	3-000-203-G/X
Razor blade		Personna	94-120-71
Micro grinder		Narishige, Japan	EG-4
Gridded microscope eyepiece		Premiere	MF-02
Micrometer		Ward’s Natural Science	94 W 9910
Ultrapure agarose		Invitrogen	15510-027
Spatula		Fisher	14-357Q
Scale		Mettler Toledo	AB54-S/FACT
Disposable weigh dishes		Fisher	2-202-B
Conventional microwave		General Electric
Erlenmeyer flask		Corning	4980
Microscope slides		Fisher	12-552
Graduated cylinder		Fisher	08-572-6D
Automatic pipette man		BrandTech	2026333
70% ethanol wash solution		Tarr	801VWR
N2 tank		Tech Air
Microinjector		Harvard apparatus	PLI-100
Micromanipulator		Micro Instruments	LTD
Dissecting microscope		Nikon	SMZ1500
Parafilm		American National Can	PM-992
Mineral oil		Sigma	M5904
Kimwipes		Kimberly-Clark	34155
gata5 splice site morpholino		Genetools, LLC		5′-TCTTAAGATTTTTACCTATACTGGA-3′
gata5 ATG Blocker		Genetools, LLC		5′-AAGATAAAGCCAGGCTCGAATACAT-3′
gata6 Long Isoform ATG Blocker		Genetools, LLC		5′-AGCTGTTATCACCCAGGTCCATCCA-3′
Disposable Pasteur Pipette		Fisher Scientific	13-678-20B
Tricaine Methanesulfonate		Argent Chemical Laboratories	MS-222
Methycellulose		ICN Biomedicals	155495
Heat Block		Fisher	11-718-4
Sharp forceps		Dumont		Size 55
Depression Microslides		VWR	48339-009