Assay RhoC activation GTPase
Summary
Ce protocole utilise un menu déroulant d'essai pour déterminer les niveaux de GTPase RhoC actifs dans les cellules.
Abstract
RhoC GTPase présente une homologie de 91% à RhoA GTPase. En raison de sa prévalence dans les cellules, de nombreux réactifs et des techniques de RhoA GTPase ont été développés. Toutefois, RhoC GTPase est exprimé dans les cellules cancéreuses métastatiques à des niveaux relativement bas. Par conséquent, quelques RhoC réactifs spécifiques ont été développés. Nous avons adapté un test d'activation de Rho GTPase pour détecter RhoC. Cette technique utilise un TPS-Rho protéine de liaison de fusion de domaine à sortir actifs GTPase RhoC. En outre, nous pouvons récolter des protéines totales au début de l'essai pour déterminer les niveaux du total (GTP et le PIB lié) GTPase RhoC. Ceci permet pour la détermination de la GTPase RhoC actifs par rapport au total dans la cellule. Plusieurs versions commerciales de cette procédure ont été développés cependant, les kits commerciaux sont optimisés pour RhoA GTPase et typiquement ne fonctionne pas bien pour RhoC GTPase. Pièces de l'essai ont été modifiés ainsi que le développement d'un anticorps spécifique RhoC.
Protocol
Discussion
L'étape la plus critique de la procédure est la nouvelle génération de TPS-RBD. Le défaut de porter une attention particulière à cette étape est la raison principale de l'échec. Toutes les étapes, de génération de la TPS-RBD (1.2) à l'incubation pendant la nuit avec le lysat cellulaire (2,5), devrait être fait en une seule journée. Une autre étape cruciale est de rendre certains qu'il ya suffisamment de cellules pour produire les lysats cellulaires. Ceci est d'une importance particuli…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Département de la Défense W81XWH-05-1-0005, W81XWH-06-1-0495, W81XWH-08-1-0029 et W81XWH-08-1-0356
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Gluthione-sepharose 4B beads | GE Healthcare | 17-0756-01 | ||
| Criterion 4-20% Tris-HCl gels | BioRad | 345-0032 |
Referências
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