Métodos para a preparação de um gel matriz injetável a partir de tecido decelularizado e injetá-lo em rato miocárdio In vivo São descritos.
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Artigo de método
Biologicamente fabricação de materiais derivados injetável para Engenharia de Tecidos do Miocárdio
Neste artigo
Resumo
Resumo
Este protocolo fornece métodos para a preparação de um gel injetável matriz extracelular (ECM) para aplicações de engenharia de tecidos do miocárdio. Resumidamente, o tecido é decelularizado liofilizada, moída, enzimaticamente digerido, e então levadas ao pH fisiológico. A liofilização remove todo o conteúdo de água do tecido, resultando em ECM seco que podem ser moídos em um pó fino com um pequeno moinho. Depois da moagem, o pó ECM é digerida com pepsina para formar uma matriz de injetáveis. Após o ajuste para pH 7,4, o material da matriz líquido pode ser injetado no miocárdio. Resultados de ensaios de caracterização prévios mostraram que os géis matriz produzida a partir de decelularizado pericárdio e miocárdio conservar os componentes ECM nativa, incluindo diversas proteínas, peptídeos e glicosaminoglicanos. Dada a utilização deste material para engenharia de tecidos, na caracterização vivo é especialmente útil, aqui, um método para a realização de uma injeção intramural para o ventrículo esquerdo (VE) da parede livre é apresentado como um meio de analisar a resposta do hospedeiro ao gel matriz em um modelo animal de pequeno porte. Acesso à cavidade torácica é adquirida através do diafragma ea injeção é feita um pouco acima do ápice na parede livre do VE. O andaime biologicamente derivada pode ser visualizado por biotina rotulagem antes da injeção e, em seguida, coloração secções de tecido com um rabanete de cavalo conjugado com peroxidase neutravidin e visualização através de coloração diaminobenzidina (DAB). Análise da região de injeção também pode ser feito com coloração histológica e imuno-histoquímico. Desta forma, o gel previamente examinadas matriz de pericárdio e miocárdio foram mostrados a forma fibrosa, redes porosas e promover a formação de vasos na região da injeção.
Protocolo
1. Pré-processamento de preparação dos tecidos
- Antes de utilizar este protocolo, é preciso ter já decelularizado o tecido de escolha. Para este exemplo, suína fresca e as amostras de pericárdio humanos são decelularizado usando lavagens hipotônica e hipertônica em água deionizada (DI) e dodecil sulfato de sódio (SDS).
- Especificamente, primeiro lave o pericárdio suíno em água DI por 30 minutos, em seguida, agitar continuamente em SDS 1% em tampão fosfato salino (PBS) por 24 horas, seguido de água a 5 horas DI enxaguar. Para pericárdio humano, primeiro lave em água DI por 30 minutos, em seguida, agitar continuamente em SDS 1% em PBS ....
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Discussão
Este método permite a geração de biologicamente derivada, andaimes injetável para a engenharia de tecidos do miocárdio. Embora estes métodos foram desenvolvidos inicialmente para a fabricação e testes in vivo de um gel matriz do miocárdio e apresentou aqui com um gel matriz de pericárdio, este protocolo pode ser adaptado para uso com qualquer tecido, desde que o tecido pode ser adequadamente descelularizados. Decelularização deve ser realizada e verificada antes da utilização destes métodos, como a presença de .......
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Divulgações
Use animal: Todos os experimentos deste estudo foram realizados de acordo com as directrizes publicadas pela Institutional Animal Care e do Comitê Use da Universidade da Califórnia, San Diego e da Associação Americana para Credenciamento de Laboratório Animal Care.
Agradecimentos
Esta pesquisa foi financiada em parte pelo Programa Novo Diretor do NIH Innovator Award, que faz parte do Roteiro NIH para Pesquisa Médica, através de concessão de número 1-DP2-OD004309-01. SBS-N. gostaria de agradecer a NSF para uma Bolsa de Investigação Pós-Graduação.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Reagentes: | |||
| Pepsina | Sigma-Aldrich | p6887-1G | Liofilizado |
| Biotina | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 21217 | |
| Neutravidina-HRP | Thomas Scientific | 21130 | |
| Equipamento: | |||
| Moedor Wiley Mini | Thomas Scientific | 3383L10 | |
| Liofilizador Labconco | Labconco Corp. | 7670520 | |
| Suprimentos cirúrgicos: | |||
| Betadine | Purdue Products L.P. | 67618-154-16 | |
| Solução de Ringer com lactato | MWI Veterinary Supply | 003966 | |
| KY Jelly | MWI Veterinary Supply | 28658 | |
| Lidocaína, 2% | MWI Veterinary Supply | 17767 | |
| Buprenorfina cloridrato | Reckitt Benckiser | 12496-0757-1 | |
| Pomada de lágrima artificial | Fisher Scientific | NC9860843 | |
| Pomada antibiótica tripla | Fisher Scientific | 19082795 | |
| Isóflurano | MWI Veterinary Supply | 60307-120-25 | |
| Otoscópio | MWI Veterinary Supply | 008699 | |
| Válvula de três vias | MWI Veterinary Supply | 006245 | |
| Sutura 3-0 Vicrile | MWI Veterinary Supply | J327H | |
| Sutura 5-0 Proline | MWI Veterinary Supply | s-1173 | |
| Agulha de corte reverso (RC) | Ethicon Inc. | 8684G | |
| Microhemostáticos | Fine Science Tools | 13013-14 | |
| Pinça micro dentada | Fine Science Tools | 11084-07 | |
| Bisturi nº 10 | Fine Science Tools | 10110-01 | |
| Tesoura romba | Fine Science Tools | 14108-09 | |
| Tesoura curva afiada | Fine Science Tools | 14085-08 | |
| Pinça grande serrilhada | Fine Science Tools | 1106-12 | |
| Tubo de sucção PE160 | BD Biosciences | 427430 | |
| Tosquiadeira | MWI Veterinary Supply | 21608 | |
| Grampos cirúrgicos/aplicador de grampos | Ethicon Inc. | PRR35 | |
| Suprimentos gerais: | |||
| Placas de agitação | |||
| HCl 0,1 M | |||
| NaOH 1 M | |||
| PBS 10x | |||
| PBS 1x | |||
| Etanol 70% | |||
| Seringas de 0,1 mL | |||
| Seringa de 10 mL | |||
| Cotonetes | |||
| Cola cirúrgica | |||
| Campo cirúrgico | |||
| Grampos para toalha | |||
| Aspirador de mão pequeno |
Referências
- Seif-Naraghi, S. B., Salvatore, M. A., Magoffin-Schup, P. J., Hu, D. P., Christman, K. L. Design and characterization of an injectable pericardial matrix gel: A potentially autologous scaffold for cardiac tissue engineering. Tissue Engineering. , (2009).
- Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F.
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Reimpressões e permissões
