Drosophila melanogaster larvas fornecer um modelo de sistema ideal para investigar os mecanismos de transporte axonal dentro larval nervos segmentares. Usando este procedimento, 3 de larvas portadores de mutações diferentes podem ser comparadas às larvas do tipo selvagem.
Abstract
Drosophila melanogaster está emergindo como um sistema poderoso modelo para estudar o desenvolvimento e função do sistema nervoso, particularmente por causa de sua genética e conveniente genoma completamente seqüenciado. Além disso, o sistema nervoso das larvas é um sistema modelo ideal para estudar mecanismos de transporte axonal como os nervos larval segmentar contêm feixes de axônios com seus corpos celulares localizados dentro do cérebro e os seus terminais terminação nervosa ao longo do comprimento do corpo. Aqui nós descrevemos o procedimento para a visualização de proteínas dentro das vesículas sinápticas larval nervos segmentares. Se feito corretamente, todos os componentes do sistema nervoso, juntamente com tecidos associados, tais como músculos e NMJs, permanecem intactas, não danificadas, e pronto para ser visualizado. 3 º larvas carregando várias mutações são dissecados, fixo, incubado com anticorpos das vesículas sinápticas, visualizados e comparados com larvas do tipo selvagem. Este procedimento pode ser adaptado para vários diferentes anticorpos synaptic ou neuronal e as mudanças na distribuição de uma variedade de proteínas pode ser facilmente observado dentro larval nervos segmentares.
Protocol
1. Preparação dos Reagentes Prepare 1x tampão Dissecção com 128 mM NaCl, 4 mM CaCl 2, 4mm MgCl 2, 2 mM KCl, HEPES 5mM e Sacarose 36mm. PH da solução a 7,2 e filtro de esterilizar. Prepare o fixador utilizando 01:01 diluição de formaldeído 16% e solução tampão 1x Dissection. Prepare 1x PBT usando 1x Tampão fosfato salino (PBS) em um PH de 7,2 e Triton X-100 em uma proporção de 1:100. Prepare 5% albumina sérica bovina (BSA) com 0,01% Na Azida …
Discussion
Os nervos Drosophila larval segmentares são um poderoso sistema para estudar mecanismos de transporte axonal. Se o 3 º instar larval dissecção é realizada corretamente, todos os componentes do SNC, SNP e tecidos associados, tais como os músculos e NMJs, pode ser examinado dentro de uma larva único. Nós adaptamos este protocolo a partir do que foi publicado por Hurd e Saxton (1996). Este protocolo também pode ser adaptado para testar outros anticorpos neuronal, mas a otimização de anticorpo…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SG é apoiado por fundos da Universidade Estadual de Nova York em Buffalo e de John R. Oishei Foundation.
Fye, S., Dolma, K., Jung Kang, M., Gunawardena, S. Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations. J. Vis. Exp. (43), e2128, doi:10.3791/2128 (2010).