Drosophila melanogaster larvas fornecer um modelo de sistema ideal para investigar os mecanismos de transporte axonal dentro larval nervos segmentares. Usando este procedimento, 3 de larvas portadores de mutações diferentes podem ser comparadas às larvas do tipo selvagem.
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Artigo de método
Visualização de Larval Nervos segmentar em 3 Rd Instar Drosophila Preparações larval
Neste artigo
Resumo
Resumo
Drosophila melanogaster está emergindo como um sistema poderoso modelo para estudar o desenvolvimento e função do sistema nervoso, particularmente por causa de sua genética e conveniente genoma completamente seqüenciado. Além disso, o sistema nervoso das larvas é um sistema modelo ideal para estudar mecanismos de transporte axonal como os nervos larval segmentar contêm feixes de axônios com seus corpos celulares localizados dentro do cérebro e os seus terminais terminação nervosa ao longo do comprimento do corpo. Aqui nós descrevemos o procedimento para a visualização de proteínas dentro das vesículas sinápticas larval nervos segmentares. Se feito corretamente, todos os componentes do sistema nervoso, juntamente com tecidos associados, tais como músculos e NMJs, permanecem intactas, não danificadas, e pronto para ser visualizado. 3 º larvas carregando várias mutações são dissecados, fixo, incubado com anticorpos das vesículas sinápticas, visualizados e comparados com larvas do tipo selvagem. Este procedimento pode ser adaptado para vários diferentes anticorpos synaptic ou neuronal e as mudanças na distribuição de uma variedade de proteínas pode ser facilmente observado dentro larval nervos segmentares.
Protocolo
1. Preparação dos Reagentes
- Prepare 1x tampão Dissecção com 128 mM NaCl, 4 mM CaCl 2, 4mm MgCl 2, 2 mM KCl, HEPES 5mM e Sacarose 36mm. PH da solução a 7,2 e filtro de esterilizar.
- Prepare o fixador utilizando 01:01 diluição de formaldeído 16% e solução tampão 1x Dissection.
- Prepare 1x PBT usando 1x Tampão fosfato salino (PBS) em um PH de 7,2 e Triton X-100 em uma proporção de 1:100.
- Prepare 5% albumina sérica bovina (BSA) com 0,01% Na Azida em 1x PBS.
2. Preparação para o Dissection
- Sylgard pratos são usados para dissecção. Prepare os pratos derramando Sylga....
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Discussão
Os nervos Drosophila larval segmentares são um poderoso sistema para estudar mecanismos de transporte axonal. Se o 3 º instar larval dissecção é realizada corretamente, todos os componentes do SNC, SNP e tecidos associados, tais como os músculos e NMJs, pode ser examinado dentro de uma larva único. Nós adaptamos este protocolo a partir do que foi publicado por Hurd e Saxton (1996). Este protocolo também pode ser adaptado para testar outros anticorpos neuronal, mas a otimização de anticorpos deve ser .......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
SG é apoiado por fundos da Universidade Estadual de Nova York em Buffalo e de John R. Oishei Foundation.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Pinça Dumont #5 | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Pinças Minutien, Aço Inoxidável | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Tesoura Reta Mcpherson-Vannas, 8 cm | Fisher Scientific | 50822236 | |
| Vectashield, Meio de Montagem | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Elastômero de Silicone Sylgard 184 | Dow Corning | 4026148 | |
| formaldeído, 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| dCSP3 | Banco de Híbridos para Estudos do Desenvolvimento | ||
| Alexa Fluor 568 Anti-Murino IgG de Cabra | Invitrogen | A-11004 |
Referências
- Gunawardena, S., Goldstein, L. Disruption of Axonal Transport and Neuronal Viability by Amyoid Precursor Protein Mutations in Drosophila. Neuron. 32 (2), 389-401 (2001).
- Gunawardena, S., Her, L. S., Brusch, R. G., Laymon, R. A., Niesman, I. R., Gordesky-Gold, B., Sintasath, L., Bonini, N. M., Goldstein, L. S.
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Reimpressões e permissões
