Single Cell Transfektion i kycklingembryon
Summary
Använda fin spets mikropipetter vi injicerar plasmid DNA i subdomäner av kyckling somites eller neural rör. Koncentrationen av plasmiden är anpassat för att generera enstaka transfekterade celler. Vi låter sedan de celler att utvecklas till klonat populationer.
Abstract
Ett centralt tema i utvecklingsbiologi är diversifiering av linjerna och att klarlägga bakomliggande molekylära mekanismer. Detta innebär en grundlig analys av öden enskilda celler under normala och experimentella förhållanden. För detta ändamål transfektion metoder som riktas mot en enda stamceller är en förutsättning. Vi beskriver här en tekniskt enkel metod för transfecting enstaka celler i kyckling vävnader i-ovo, vilket gör att tillförlitliga härkomst spårning och genmanipulation. Specifik vävnad domäner är riktade i somit eller neuralrörsdefekter, och DNA injiceras direkt i epitelet av intresse, vilket resulterar i sporadiska transfektion av enskilda celler. Använda reportrar kan klonal populationer därmed spåras i upp till tre dagar, och beteendet hos genmanipulerade klonal populationer kan jämföras med det av kontrollerna. Denna metod utnyttjar tillgängligheten till kycklingembryo tillsammans med nya verktyg för genetisk manipulation. Vi jämför och diskutera dess fördelar jämfört med utbredda elektroporation metoden, och möjliga tillämpningar och användning i ytterligare in vivo-modeller är också föreslås. Vi förespråkar användandet av denna metod som ett viktigt tillskott och komplement till befintliga härstamning spåra och genetiska verktyg störningar.
Protocol
Discussion
Metoden som beskrivs ovan är en modifiering av ett tidigare beskrivits teknik för att leverera lipofila färgämnen till småcellig undergrupper eller enstaka stamfäder 3. Det har tre huvudsakliga fördelar jämfört med vanliga elektroporation teknik. Det första ger det en möjlighet för märkning med tillförsikt diskreta platser i målvävnader, så mycket större rumslig upplösning än elektroporation (se till exempel Figur 1B, C). För det andra tillåter det märkning av enskilda celler, vilket g?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Shlomi Krispin för neuralrörsdefekter bilden. I synnerhet erkänner vi Yuval Kanel för att inleda tekniken GFP transfektion. Detta arbete har finansierats med bidrag från Israel Science Foundation, Association Francaise contre les myopatier och Deutche Forschungsgemeinshaft, Collaborative Research Centre 488 till CK
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Pipette tubes | Sutter Instrument | B100-75-10 | ||
| Capillaries | Drummond Scientific | 2-000-100 | ||
| Insect needles | Watkins & Doncaster | E6871 | ||
| Pen-Strep solution | Biological Industries | 03-031-1B |
Referências
- Ben-Yair, R., Kalcheim, C. Lineage analysis of the avian dermomyotome sheet reveals the existence of single cells with both dermal and muscle progenitor fates. Development. 132, 689-701 (2005).
- Ben-Yair, R., Kalcheim, C. Notch and bone morphogenetic protein differentially act on dermomyotome cells to generate endothelium, smooth, and striated muscle. J Cell Biol. 180, 607-618 (2008).
- Cinnamon, Y., Kahane, N., Kalcheim, C. Characterization of the early development of specific hypaxial muscles from the ventrolateral myotome. . Development. 126, 4305-4315 (1999).
- Stark, D. A., Kulesa, P. M. Photoactivatable green fluorescent protein as a single-cell marker in living embryos. Dev Dyn. 233, 983-992 (2005).
- Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo–from single cells to the entire brain. Differentiation. 70, 148-154 (2002).
- Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. Single-cell electroporation for gene transfer in vivo. Neuron. 29, 583-591 (2001).
- Hewapathirane, D. S., Haas, K. Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain. J Vis Exp. , (2008).
- Nagai, T. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nat Biotechnol. 20, 87-90 (2002).
- Sato, Y. Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos. Dev Biol. 305, 616-624 (2007).
