Injection intracrânienne des vecteurs adéno-associés virale
Summary
Nous présentons ici l'injection intracrânienne de vecteurs AAV pour le marquage fluorescent des neurones et cellules gliales dans le cortex visuel.
Abstract
L'injection intracrânienne de vecteurs viraux pour exprimer une protéine fluorescente est une technique de marquage polyvalent pour la visualisation des sous-ensembles spécifiques de cellules dans différentes régions du cerveau in vivo et dans les sections du cerveau. Contrairement à l'injection de colorants fluorescents, l'étiquetage virale offre ciblant des types cellulaires individuels et est moins coûteux et fastidieux que d'établir des lignées de souris transgéniques. Dans cette technique, une viraux adéno-associés (AAV) est injecté par voie intracrânienne en utilisant les coordonnées stéréotaxique, une micropipette et une pompe automatique pour la livraison précise de l'AAV à la zone désirée avec un minimum de dommages aux tissus environnants. Paramètres d'injection peuvent être adaptées à des expériences individuelles en ajustant l'âge des animaux à un taux d'injection, l'emplacement d'injection, le volume d'injection, d'injection, AAV de sérotype et le promoteur dirigeant l'expression des gènes. Selon les conditions choisies, viro-induit l'expression du transgène peut permettre la visualisation des groupes de cellules, des cellules individuelles ou d'une amende de processus cellulaires, jusqu'au niveau des épines dendritiques. L'expérience montre ici représente une injection de double-brin AAV exprimant la protéine fluorescente verte pour l'étiquetage des neurones et cellules gliales dans le cortex visuel primaire de souris.
Protocol
Discussion
Livraison de gènes médiée par Virally détient un grand potentiel pour l'étude des processus neurologiques et le traitement des troubles du cerveau 1,2,3. La grande polyvalence de cette technique peut aussi être exploitée pour marquer les cellules par fluorescence pour l'imagerie in vitro et in vivo 4. Ici nous démontrons une procédure détaillée pour la transduction de neurones et cellules gliales dans le cortex visuel de la souris en utilisant un double brin d&#…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été rendu possible par des subventions du NIH (EY012977), une bourse de carrière dans les sciences biomédicales de l'Burroughs Wellcome Fund, la Fondation de Whitehall, et la Sloan Foundation (AKM).
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Stoelting Mouse and Neonatal Rat Adaptor | Stoelting | 51625 | Regular stereotax for securing animals for surgery may be substituted | |
| Extra Fine Bonn Scissors, 8.5cm, straight tip, cutting edge 13mm | Fine Science Tools | 14084-08 | ||
| Eye Dressing Forceps, 10cm, tip width 0.5mm, curved | Fine Science Tools | 11152-10 | ||
| Dumont #5/45 Forceps- Dumoxel Standard Tip, 11cm, angled | Fine Science Tools | 11251-35 | Extra-fine tipped forceps for performing craniotomy | |
| Standard Pattern Forceps, straight, 2.5mmx1.35mmtip, 12cm | Fine Science Tools | 11000-12 | ||
| Microtorque Control Box and Tech2000 handpiece | Ram Products, Inc. | TECH2000ON/OFF | Dental drill | |
| Micro Drill Stainless Steel Burrs 1.4mm tip diameter | Fine Science Tools | 19008-14 | ||
| Wiretrol micropipettes, to deliver 1-5 Ul | VWR International/ Drummond | 5-000-1001 or 53480-287 | ||
| Mineral oil | VWR International | 29447-338 | ||
| Manual Micromanipulator and Tilting Base (right-handed) | World Precision Instruments, Inc. | M3301-M3-R | Used for determining stereotaxic co-ordinates | |
| UltraMicroPump (UMP3) (one) with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments, Inc. | UMP3-1 | ||
| Sutures | VWR International | 95056-952 | ||
| P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | ||
| Tobradex | Available from your institution’s veterinary services |
Referências
- Kaplitt, M. G., Leone, P., Samulski, R. J., Xiao, X., Pfaff, D. W., O’Malley, K. L., During, M. J. Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian brain. Nat Genet. 8, 148-154 (1994).
- Harding, T. C., Dickinson, P. J., Roberts, B. N., Yendluri, S., Gonzalez-Edick, M., Lecouteur, R. A., Jooss, K. U. Enhanced gene transfer efficiency in the murine striatum and an orthotopic glioblastoma tumor model, using AAV-7- and AAV-8-pseudotyped vectors. Hum Gene Ther. 17, 807-820 (2006).
- Lo, W. D., Qu, G., Sferra, T. J., Clark, R., Chen, R., Johnson, P. R. Adeno-associated virus-mediated gene transfer to the brain: duration and modulation of expression. Hum Gene Ther. 10, 201-213 (1999).
- Lowery, R. L., Zhang, Y., Kelly, E. A., Lamantia, C. E., Harvey, B. K., Majewska, A. K. Rapid long-term labeling of cells in the developing and adult rodent visual cortex using double-stranded adeno-associated viral vectors. Dev Neurobiol. 69, 674-688 (2009).
