Summary

Intracraniële Injectie van adeno-geassocieerde virale vectoren

Published: November 17, 2010
doi:

Summary

Hier presenteren we de intracraniële injectie van AAV-vectoren voor TL-etikettering van neuronen en glia in de visuele cortex.

Abstract

Intracraniële injectie van virale vectoren ontwikkeld om een fluorescerend eiwit tot expressie is een veelzijdige labeling techniek voor visualisatie van specifieke subsets van cellen in verschillende hersengebieden, zowel in vivo en in de hersenen secties. In tegenstelling tot de injectie van fluorescerende kleurstoffen, virale etikettering biedt targeting van individuele celtypen en is minder kostbaar en tijdrovend dan het vaststellen van transgene muis lijnen. In deze techniek wordt een adeno-geassocieerde virale (AAV) vector geïnjecteerd met behulp van intracranially stereotaxische coördinaten, een micropipet en een automatische pomp voor precieze aflevering van AAV naar het gewenste gebied met minimale schade aan het omringende weefsel. Injectie parameters kunnen worden aangepast aan de individuele experimenten door het aanpassen van het dier leeftijd bij injectie, injectie locatie, het volume van de injectie, de mate van injectie, AAV serotype en de promotor rijden genexpressie. Afhankelijk van de gekozen omstandigheden kunnen viraal geïnduceerde transgenexpressie laten visualisatie van groepen cellen, individuele cellen of fijne cellulaire processen, tot op het niveau van de dendritische spines. Het experiment hier getoond toont een injectie van double-stranded AAV uiten van groen fluorescerend eiwit voor de etikettering van neuronen en glia in de muis primaire visuele cortex.

Protocol

1. Virus Hantering en opslag Een goede bescherming en handling technieken moeten worden gekozen op basis van het bioveiligheidsniveau van het virus te worden gebruikt. Deze praktijken zijn te vinden in Bioveiligheid in Microbiologische en Biomedische Laboratories 5 e editie, beschikbaar op de website van CDC ( http://www.cdc.gov/od/OHS/biosfty/bmbl5/bmbl5toc.htm ). Het gebruik van AAV vectoren is goedgekeurd voor bioveilighei…

Discussion

Viraal gemedieerde genafgifte biedt veel mogelijkheden voor de studie van neurologische processen en behandeling van hersenaandoeningen 1,2,3. De grote veelzijdigheid van deze techniek kan ook worden benut om fluorescent label-cellen voor het afbeelden van zowel in vitro als in vivo 4. Hier laten we zien een gedetailleerde procedure voor de transductie van neuronen en glia in de muis visuele cortex met behulp van een double-stranded adeno-vereniging virus dat versterkt groen fluorescent ei…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd mogelijk gemaakt door subsidies van de NIH (EY012977), een Career Award in de Biomedische Wetenschappen aan de Burroughs Wellcome Fonds, de Stichting Whitehall, en de Sloan Foundation (AKM).

Materials

Material Name Tipo Company Catalogue Number Comment
Stoelting Mouse and Neonatal Rat Adaptor   Stoelting 51625 Regular stereotax for securing animals for surgery may be substituted
Extra Fine Bonn Scissors, 8.5cm, straight tip, cutting edge 13mm   Fine Science Tools 14084-08  
Eye Dressing Forceps, 10cm, tip width 0.5mm, curved   Fine Science Tools 11152-10  
Dumont #5/45 Forceps- Dumoxel Standard Tip, 11cm, angled   Fine Science Tools 11251-35 Extra-fine tipped forceps for performing craniotomy
Standard Pattern Forceps, straight, 2.5mmx1.35mmtip, 12cm   Fine Science Tools 11000-12  
Microtorque Control Box and Tech2000 handpiece   Ram Products, Inc. TECH2000ON/OFF Dental drill
Micro Drill Stainless Steel Burrs 1.4mm tip diameter   Fine Science Tools 19008-14  
Wiretrol micropipettes, to deliver 1-5 Ul   VWR International/ Drummond 5-000-1001 or 53480-287  
Mineral oil   VWR International 29447-338  
Manual Micromanipulator and Tilting Base (right-handed)   World Precision Instruments, Inc. M3301-M3-R Used for determining stereotaxic co-ordinates
UltraMicroPump (UMP3) (one) with SYS-Micro4 Controller   World Precision Instruments, Inc. UMP3-1  
Sutures   VWR International 95056-952  
P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller   Sutter Instruments P-97  
Tobradex       Available from your institution’s veterinary services

Referências

  1. Kaplitt, M. G., Leone, P., Samulski, R. J., Xiao, X., Pfaff, D. W., O’Malley, K. L., During, M. J. Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian brain. Nat Genet. 8, 148-154 (1994).
  2. Harding, T. C., Dickinson, P. J., Roberts, B. N., Yendluri, S., Gonzalez-Edick, M., Lecouteur, R. A., Jooss, K. U. Enhanced gene transfer efficiency in the murine striatum and an orthotopic glioblastoma tumor model, using AAV-7- and AAV-8-pseudotyped vectors. Hum Gene Ther. 17, 807-820 (2006).
  3. Lo, W. D., Qu, G., Sferra, T. J., Clark, R., Chen, R., Johnson, P. R. Adeno-associated virus-mediated gene transfer to the brain: duration and modulation of expression. Hum Gene Ther. 10, 201-213 (1999).
  4. Lowery, R. L., Zhang, Y., Kelly, E. A., Lamantia, C. E., Harvey, B. K., Majewska, A. K. Rapid long-term labeling of cells in the developing and adult rodent visual cortex using double-stranded adeno-associated viral vectors. Dev Neurobiol. 69, 674-688 (2009).
check_url/pt/2140?article_type=t

Play Video

Citar este artigo
Lowery, R. L., Majewska, A. K. Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors. J. Vis. Exp. (45), e2140, doi:10.3791/2140 (2010).

View Video