Inyección intracraneal de adeno-asociado vectores virales
Summary
Aquí presentamos la inyección intracraneal de vectores AAV de marcaje fluorescente de las neuronas y la glía en la corteza visual.
Abstract
Inyección intracraneal de vectores virales para expresar una proteína fluorescente es una técnica de etiquetado versátil para la visualización de grupos específicos de células en diferentes regiones del cerebro, tanto en vivo y en secciones de cerebro. A diferencia de la inyección de colorantes fluorescentes, etiquetado viral ofrece focalización de los tipos de células y es menos costoso y consume mucho tiempo que el establecimiento de líneas de ratones transgénicos. En esta técnica, un virus adeno-asociados (AAV) vector se inyecta por vía intracraneal mediante coordenadas estereotáxica, una micropipeta y una bomba automática para la entrega precisa de AAV en la zona deseada con el mínimo daño a los tejidos circundantes. Los parámetros de inyección se pueden adaptar a los distintos experimentos mediante el ajuste de la edad del animal a una velocidad de inyección, la ubicación de la inyección, el volumen de la inyección, la inyección, el serotipo AAV y el promotor dirige la expresión de genes. Dependiendo de las condiciones elegidas, de forma viral inducida por la expresión del transgén puede permitir la visualización de grupos de células, las células individuales o bien los procesos celulares, hasta el nivel de las espinas dendríticas. El experimento que se muestra aquí muestra una inyección de doble cadena AAV que expresa la proteína verde fluorescente para el etiquetado de las neuronas y la glía en la corteza visual primaria del ratón.
Protocol
Discussion
Viral mediada por la entrega de genes tiene un gran potencial para el estudio de los procesos neurológicos y el tratamiento de trastornos cerebrales 1,2,3. La gran versatilidad de esta técnica también puede ser aprovechado para marcar con fluorescencia células para obtener imágenes tanto de vitro como in vivo 4. Aquí se demuestra un procedimiento detallado para la transducción de las neuronas y la glía en la corteza visual del ratón con una doble cadena adeno-virus que ex…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue posible gracias a subvenciones del NIH (EY012977), el Premio de carrera en las Ciencias Biomédicas del Fondo Burroughs Wellcome, la Fundación de Whitehall, y la Fundación Sloan (AKM).
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Stoelting Mouse and Neonatal Rat Adaptor | Stoelting | 51625 | Regular stereotax for securing animals for surgery may be substituted | |
| Extra Fine Bonn Scissors, 8.5cm, straight tip, cutting edge 13mm | Fine Science Tools | 14084-08 | ||
| Eye Dressing Forceps, 10cm, tip width 0.5mm, curved | Fine Science Tools | 11152-10 | ||
| Dumont #5/45 Forceps- Dumoxel Standard Tip, 11cm, angled | Fine Science Tools | 11251-35 | Extra-fine tipped forceps for performing craniotomy | |
| Standard Pattern Forceps, straight, 2.5mmx1.35mmtip, 12cm | Fine Science Tools | 11000-12 | ||
| Microtorque Control Box and Tech2000 handpiece | Ram Products, Inc. | TECH2000ON/OFF | Dental drill | |
| Micro Drill Stainless Steel Burrs 1.4mm tip diameter | Fine Science Tools | 19008-14 | ||
| Wiretrol micropipettes, to deliver 1-5 Ul | VWR International/ Drummond | 5-000-1001 or 53480-287 | ||
| Mineral oil | VWR International | 29447-338 | ||
| Manual Micromanipulator and Tilting Base (right-handed) | World Precision Instruments, Inc. | M3301-M3-R | Used for determining stereotaxic co-ordinates | |
| UltraMicroPump (UMP3) (one) with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments, Inc. | UMP3-1 | ||
| Sutures | VWR International | 95056-952 | ||
| P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | ||
| Tobradex | Available from your institution’s veterinary services |
Referências
- Kaplitt, M. G., Leone, P., Samulski, R. J., Xiao, X., Pfaff, D. W., O’Malley, K. L., During, M. J. Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian brain. Nat Genet. 8, 148-154 (1994).
- Harding, T. C., Dickinson, P. J., Roberts, B. N., Yendluri, S., Gonzalez-Edick, M., Lecouteur, R. A., Jooss, K. U. Enhanced gene transfer efficiency in the murine striatum and an orthotopic glioblastoma tumor model, using AAV-7- and AAV-8-pseudotyped vectors. Hum Gene Ther. 17, 807-820 (2006).
- Lo, W. D., Qu, G., Sferra, T. J., Clark, R., Chen, R., Johnson, P. R. Adeno-associated virus-mediated gene transfer to the brain: duration and modulation of expression. Hum Gene Ther. 10, 201-213 (1999).
- Lowery, R. L., Zhang, Y., Kelly, E. A., Lamantia, C. E., Harvey, B. K., Majewska, A. K. Rapid long-term labeling of cells in the developing and adult rodent visual cortex using double-stranded adeno-associated viral vectors. Dev Neurobiol. 69, 674-688 (2009).
