Här presenterar vi de intrakraniella injektion av AAV vektorer för fluorescerande märkning av nervceller och Glia i syncentrum.
Abstract
Intrakraniell injektion av virala vektorer konstruerad för att uttrycka en fluorescerande proteinet är en mångsidig märkning teknik för visualisering av specifika undergrupper av celler i olika områden i hjärnan både in vivo och i hjärnan sektioner. Till skillnad från injektion av fluorescerande färger, erbjuder virus märkning inriktning av enskilda celltyper och är billigare och tidskrävande än upprättandet transgen mus linjer. Med den här tekniken är en Adeno-associerad viral (AAV) vektor injiceras intracranially med stereotaxic koordinater, en mikropipett och en automatisk pump för exakt leverans av AAV till önskat område med minimal skada på omgivande vävnad. Injektion parametrar kan skräddarsys för enskilda experiment genom att anpassa djuret ålder vid injektion, injektionen plats, volym injektion, infusionshastighet, AAV serotyp och initiativtagaren körning genuttryck. Beroende på vald förhållanden kan viralt inducerad transgenen uttryck tillåter visualisering av grupper av celler, enskilda celler eller fina cellulära processer, ner till nivån Dendritutskotten. Experimentet visas här skildrar en injektion av dubbel-strängat AAV uttrycker grönt fluorescerande protein för märkning av nervceller och Glia i musens primära syncentrum.
Protocol
1. Virus Hantering och lagring Lämpligt skydd och tekniker hantering bör väljas utifrån biosäkerhetsnivån av viruset som ska användas. Dessa metoder kan hittas i biosäkerhet i mikrobiologiska och biomedicinska laboratorier 5: e upplagan, tillgänglig på CDC webbplats ( http://www.cdc.gov/od/OHS/biosfty/bmbl5/bmbl5toc.htm ). Användningen av AAV vektorer är godkänd för Biosafety Level 1 (BSL-1). För experimentet v…
Discussion
Viralt-medierad gen leverans innebär stora möjligheter för att studera neurologiska processer och behandling av sjukdomar i hjärnan 1,2,3. Den stora mångsidigheten hos denna teknik kan också utnyttjas för att fluorescerande etikett celler för avbildning både in vitro och in vivo4. Här visar vi ett detaljerat förfarande för transduktion av nervceller och Glia i mus syncentrum med en dubbel-strängat Adeno-föreningen virus som uttrycker förbättrade grönt fluorescera…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete har möjliggjorts genom anslag från NIH (EY012977), en karriär Award i biomedicin från Burroughs Wellcome Fund, Whitehall Foundation och Sloan Foundation (AKM).
Materials
Material Name
Tipo
Company
Catalogue Number
Comment
Stoelting Mouse and Neonatal Rat Adaptor
Stoelting
51625
Regular stereotax for securing animals for surgery may be substituted
Extra Fine Bonn Scissors, 8.5cm, straight tip, cutting edge 13mm
Fine Science Tools
14084-08
Eye Dressing Forceps, 10cm, tip width 0.5mm, curved
Fine Science Tools
11152-10
Dumont #5/45 Forceps- Dumoxel Standard Tip, 11cm, angled
Fine Science Tools
11251-35
Extra-fine tipped forceps for performing craniotomy
Standard Pattern Forceps, straight, 2.5mmx1.35mmtip, 12cm
Fine Science Tools
11000-12
Microtorque Control Box and Tech2000 handpiece
Ram Products, Inc.
TECH2000ON/OFF
Dental drill
Micro Drill Stainless Steel Burrs 1.4mm tip diameter
Fine Science Tools
19008-14
Wiretrol micropipettes, to deliver 1-5 Ul
VWR International/ Drummond
5-000-1001 or 53480-287
Mineral oil
VWR International
29447-338
Manual Micromanipulator and Tilting Base (right-handed)
World Precision Instruments, Inc.
M3301-M3-R
Used for determining stereotaxic co-ordinates
UltraMicroPump (UMP3) (one) with SYS-Micro4 Controller
World Precision Instruments, Inc.
UMP3-1
Sutures
VWR International
95056-952
P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller
Sutter Instruments
P-97
Tobradex
Available from your institution’s veterinary services