Colture cellulari primarie da Drosophila Gastrula embrioni
Summary
Forniamo un protocollo dettagliato per la preparazione di cellule primarie dissociata dalla<em> Drosophil</em> Un embrioni. La possibilità di effettuare la perturbazione efficace RNAi, insieme ad altri metodi di imaging molecolare, biochimici e cellulari che permette ad una serie di questioni da affrontare in<em> Drosophila</em> Cellule primarie.
Abstract
Qui si descrive un metodo per la preparazione e la coltura di cellule primarie dissociato da embrioni di Drosophila gastrula. In breve, una grande quantità di embrioni in scena dalle mosche giovani e sani sono raccolti, sterilizzati, e poi fisicamente dissociato in una sospensione singola cella utilizzando un omogeneizzatore di vetro. Dopo essere stato placcato su piastre di coltura o le diapositive da camera alla densità adeguata nel terreno di coltura, queste cellule possono ulteriormente differenziarsi in diversi tipi di cellule-morfologicamente distinte, che possono essere identificati dal loro marker cellulari specifici. Inoltre, vi presentiamo le condizioni per il trattamento di queste cellule a doppia elica (ds) RNA a suscitare knockdown gene. RNAi in cellule di Drosophila efficiente primaria si ottiene semplicemente fare il bagno le cellule in dsRNA contenenti terreno di coltura. La capacità di effettuare efficaci perturbazione RNAi, insieme ad altri molecolare, biochimica, analisi di imaging cellulare, permetterà una serie di domande a cui rispondere in cellule di Drosophila primarie, in particolare quelli relativi alla muscolari differenziate e cellule neuronali.
Protocol
Discussion
Il modello di sviluppo di colture primarie di cellule di Drosophila può variare notevolmente, probabilmente a causa delle diverse variabili durante il processo di preparazione delle cellule primarie. Prima di tutto, vola per la posa delle uova devono essere giovani (entro una settimana di vita) e sano (privo di infezione virale o batterica). Embrioni non fecondati o infette devono essere evitati, in quanto sono inutili e le cellule derivate da questi embrioni non possono differenziare e potrà sopravvivere sol…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JB è stato sostenuto dal Damon Runyon Cancer Research Foundation Fellowship DRG-1716-02. JZ è stato sostenuto da NIH / NIGMS Fellowship GM082174 F32-02. NP è un investigatore del Howard Hughes Medical Institute.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Shields and Sang M3 medium | Sigma | S3652 | ||
| Fetal bovine serum | JRH Biosciences | 12103-500M | ||
| Insulin from bovine pancreas | Sigma | I-6634 | ||
| Large embryo collection cages | Genesee Scientific | 59-101 | ||
| #25 US standard testing sieve | VWR | 57334-454 | ||
| #45 US standard testing sieve | VWR | 57334-462 | ||
| #120 US standard testing sieve | VWR | 57334-474 | ||
| Dounce tissue grinder, Wheaton 7 mL | VWR | 62400-620 | ||
| Dounce tissue grinder,Kontes 40 mL | VWR | KT885300-0040 | ||
| Dounce tissue grinder,Kontes 40 mL | VWR | KT885300-0100 | ||
| Costar, 384-well plate | VWR | 29444-078 | ||
| Lab-Tek II Chambered coverglass | Fisher Scientific | 171080 |
Referências
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- Bai, J., Hartwig, J. H., Perrimon, N. S. A. L. S. a WH2-domain-containing protein, promotes sarcomeric actin filament elongation from pointed ends during Drosophila muscle growth. Dev. Cell. 13, 828-842 (2007).
- Bai, J. RNA interference screening in Drosophila primary cells for genes involved in muscle assembly and maintenance . Development. 135, 1439-1449 (2008).
- Sepp, K. J. Identification of neural outgrowth genes using genome-wide RNAi. PloS. Genet. 4, e1000111-e1000111 (2008).
- Donady, J. J., Fyrberg, E. Mass culturing of Drosophila embryonic cells in vitro. TCA Manual. 3, 685-687 (1977).
- Seecof, R. L., Alleaume, N., Teplitz, R. L., Gerson, I. Differentiation of neurons and myocytes in cell cultures made from Drosophila gastrulae. Exp. Cell Res. 69, 161-173 (1971).
- Bai, J., Sepp, K. J., Perrimon, N. Culture of Drosophila primary cells dissociated from gastrula embryos and their use in RNAi screening. Nature Protocols. 4, 1502-1512 (2009).
