דג הזברה התפתחה חזקה<em> In vivo</em> פלטפורמה פנוטיפ מבוססי מסכי סמים אנליזה כימית גנטית. הנה, אנחנו מדגימים שיטה פשוטה, מעשית להקרנה בקנה מידה גדול של מולקולות קטנות באמצעות עוברי דג הזברה.
Abstract
לאור גודל העובר הקטן שלהם, הפיתוח המואץ, שקיפות, פוריות, ונקודות הדמיון המולקולרי, מורפולוגיים ופיזיולוגיים רבים יונקים, דג הזברה התפתחה חזקה<em> In vivo</em> פלטפורמה פנוטיפ מבוססי מסכי סמים אנליזה כימית גנטית. הנה, אנחנו מדגימים שיטה פשוטה, מעשית להקרנה בקנה מידה גדול של מולקולות קטנות באמצעות עוברי דג הזברה.
Protocol
1) דג הזברה אוסף ביצה באחר הצהריים שלפני יום של המסך כימיים, להקים 10-20 רבייה טנקים דג הזברה. ממלאים כל מיכל עם מים ממערכת מדגה. שימוש נטו דג, העברת זכר אחד בוגר 1-2 נקבות בוגרות למיכל הפנימי במיכל כל הרבייה. הפרד את הדג הזכר…
Discussion
כאשר מתכננים דג הזברה מסך מבוססי כימיים, תשומת לב מיוחדת יש לשלם חוסנו של פנוטיפ הנדונה לבין שיעור הרקע של פנוטיפ כזה. הדבר חשוב במיוחד עבור מסכי עבור מדכאי הכימי של פנוטיפ המושרה. לדוגמה, עבור פנוטיפ הנגרם על ידי אינדוקציה חום הלם transgene, מצב שגורם את הפנוטיפ reproducibly חי?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Materials
Minimum of 20 pairs of adult zebrafish of desired genotype.
Fish nets, Breeding tanks, with removable inner container and dividers (Aquatic Habitats).
Manual pipette pump, 10 mL (Bel-Art Products, Pequannock, NJ).
E3 embryo medium: 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2 , 0.33 mM MgSO4 , containing 0.003% PTU (phenylthio-carbamide, Sigma; St. Louis, MO). PTU can be prepared as a 10x solution by dissolving 0.3-g PTU in 1 L of E3 embryo media. Solutions containing PTU should be protected from light by covering with aluminum foil.
12-channel pipettes, 2-20 μL (Eppendorf).
12-channel pipettes, 3-300 μL (Eppendorf).
Disposable polystyrene pipette basin, 50 mL (Fisher Scientific).
Small molecule library of structurally diverse compounds arrayed in a 96-wll format at 10 mM stock in DMSO. Each master plate is aliquoted into 96-well polypropylene storage plates (Corning), and stored at -80°C until use.
Aluminum sealing tape for 96-well plates (Nunc, Rochester, NY).
DMSO (Sigma, St. Louis, MO).
Basic incubator, 28.5°C (Fisher Scientific).
Stereomicroscope with transmitted light base (Leica Microsystems, Bannockburn, IL).
Hao, J., Williams, C. H., Webb, M. E., Hong, C. C. Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen. J. Vis. Exp. (46), e2243, doi:10.3791/2243 (2010).